蛋白质内含子(intein)是存在于前体蛋白质中的一段插入序列,其两侧的氨基酸序列称为蛋白质外显子(extein)。在蛋白质翻译后加工成熟过程中,蛋白质内含子从前体蛋白质中自我剪切,并将两侧的蛋白质外显子以天然肽键连接形成成熟的有功能的蛋白质,这一过程被称为蛋白质内含子介导的蛋白质剪接(intein-mediated protein splicing)。蛋白质内含子根据其结构特征可分为三类,即标准蛋白质内含子(canonical intein),微小蛋白质内含子(mini-intein)和断裂蛋白质内含子(split-intein)。蛋白质内含子的一级结构序列中有四个位点的氨基酸残基比较保守,分别为：蛋白质内含子N端第一个氨基酸残基一般是Cys或Ser,到目前为止还没有在天然的intein中发现Thr；模体B中有一个非常保守的Thr-X-X-His序列,X代表任何氨基酸残基；模体G中蛋白质内含子末位氨基酸残基一般是Asn,倒数第二位氨基酸残基也非常保守,一般是His；下游蛋白质外显子N端的第一个氨基酸残基一般是Cys, Ser或Thr。但是,这些模体中的保守氨基酸残基并不是绝对的,现在发现越来越多的例外。蛋白质内含子和下游蛋白质外显子的第一个氨基酸残基包含了剪接所需要的全部信息,不需要外界辅酶或辅因子的参与。标准蛋白质内含子介导的蛋白质剪接包括四步亲核反应：1)蛋白质内含子N端第一个氨基酸残基的侧链亲核基团-OH/-SH对上游extein和intein之间的肽键发动亲核攻击,发生N-O/N-S酰基化重排,上游extein转移到N端第一个氨基酸残基的侧链上,形成(硫)酯键Ⅰ；2)下游extein N端第一个氨基酸残基的侧链亲核基团-OH/-SH对(硫)酯键Ⅰ进行亲核攻击,上游extein转移到下游extein N端第一个氨基酸残基的侧链上,形成(硫)酯键Ⅱ并形成分支中间产物；3)intein的最后一个氨基酸残基(一般为Asn)环化生成琥珀酰亚胺环,释放intein; 4) (硫)酯键Ⅱ发生O-N/S-N酰基重排,形成天然肽键,连接上游extein和下游extein,此步自发进行。在应用intein剪接外源蛋白时最重要的一点是在宿主蛋白中选择一个合适的插入位点,因为+1位的氨基酸残基直接参与蛋白质剪接反应,位点选择不合适可能会导致intein的剪接活性被抑制。Intein的剪接反应在催化活性中心完成,由保守位点的氨基酸残基通过氢键和疏水作用力相互作用形成。位于活性中心的intein的第一个氨基酸残基(1位)和下游extein的第一个氨基酸残基(+1位)通常为亲核氨基酸,Cys, Ser或Thr,但是对于一个intein来说我们还不清楚这三个氨基酸残基是否能够互相替换,1位和+1位是不是存在着特定的组合,或者自然界中的intein对这两个位点的组合是不是有一个偏爱性?为了回答这些问题在第三章中我们首次分析了NEB网站上已经报道的500多个intein的1位和+1位氨基酸残基的分布及组合特性,同时我们选取了6个已知具有剪接活性的mini-intein,通过定点突变将每一个intein的1位和+1位的原始氨基酸残基分别突变为另外两种亲核氨基酸,每一个intein得到9种不同组合并检测其剪接活性。统计结果表明目前已经发现的intein中1位大部分为Cys,少量为Ser还没有发现Thr的存在；本实验结果显示将6个mini-intein的1位的Cys突变为Ser或Thr之后,除一个intein剪接活性降低之外其余的所有突变体剪接活性都被抑制。自然界存在的intein中Cys和Ser在+1都广泛存在,Thr占少数,将6个mini-intein+1位的Cys和Ser互换之后发现对intein的剪接活性基本上没有影响。当这两个位点的氨基酸残基作为一个组合1/+l组合进行研究时,统计结果显示在自然界中Cys/Ser组合的intein数量最多,而没有发现Ser/Cys组合,同样我们的实验结果也发现6个mini-intein的Cys/Ser组合都有剪接活性,而Ser/Cys都没有剪接活性。这些发现对于蛋白质剪接机制以及在目标蛋白中选择合适的插入位点提供了有意义的数据,同时我们还得到了两个剪接活性较高且+l位为Thr的mini-intein。Intein的四步剪接反应是可以独立进行的,例如将1位的氨基酸残基突变为Ala,那么第一步剪接反应则不能发生,但是第三步Asn环化可以继续进行,因此导致C端断裂反应,释放C端extein;如果将intein的最后一个氨基酸残基Asn突变为Ala,第三步和第四步反应就被阻止,只能发生前两步反应,生成的酯键被水解导致N端断裂反应,释放N端extein。Intein的断裂反应在蛋白质工程领域中得到了广泛应用,用来进行蛋白纯化,连接和环化等,例如NEB公司商业化的的IMPACTM蛋白纯化载体就是利用intein的N端和C端断裂反应实现了蛋白的一步纯化。但是,这些方法利用的都是完整的mini-intein, intein和目的蛋白在宿主体内融合表达之后往往会发生一些自发断裂反应,甚至有的可以达到80%,因此大大降低了目的蛋白的产量,增加了成本。在第四章中我们报道了一种新的方法,利用断裂蛋白内含子的片段互补实现对intein断裂反应的可控,从而避免体内自发断裂。我们利用S11型断裂蛋白内含子实现对intein N端断裂的控制,用S1型断裂蛋白内含子实现对intein C端断裂的控制。在N端断裂反应的设计中,四个S11型断裂蛋白内含子Ssp DnaX, Ter ThyX, Ssp GyrB和Rma DnaB的N端序列(S 11-IN)与大肠杆菌麦芽糖蛋白(MBP)融合形成前体蛋白,在大肠杆菌中表达纯化,体外加入化学合成的Ssp GyrB S11 split-intein的C端序列(Ic:GVFVHN)和DTT。结果表明,除了Ter ThyX之外都可以发生N-cleavage,而体内表达和纯化过程中,除了Rma DnaB有少量的自发断裂外其余的三个intein都没有自发断裂发生,而且在只有DTT存在时也可以引发断裂反应。在C端断裂的设计中,四个S1型断裂蛋白内含子Ssp DnaX, Ter ThyX, Ssp GryB和DnaB的C端序列(S1-IC)与大肠杆菌硫氧还蛋白(Trx)融合表达,纯化后在体外加入化学合成的Ssp DnaB S1 split-intein的N端序列(IN:CISGDSLISLA)。结果表明,除了SspDnaX在体内有自发断裂外,其余三个intein都没有自发断裂发生,体外加入IN和DTT可以诱发断裂反应。本实验利用小肽和intein大片段的互补形成完整的intein结构,从而恢复intein的活性来控制其N端或C端断裂反应,同时我们利用一个intein的小肽来控制多个intein的断裂反应。因此,本实验不仅提供了一个经济有效的方法避免intein的自发断裂,还对intein的结构有了进一步的了解。Liu等对Ssp DnaB S1 split-intein的研究以及我们对Ter ThyX, Ssp GyrB和Rma DnaB三个S1 split-intein的研究发现,缺失11aa的S1-IN片段之后剩余的S1-Ic片段没有任何的cleavage和splicing活性,只有在体外加入S1-IN片段才可以诱发S1-Ic片段发生C-cleavage,而对于Ssp DnaX intein结果却相反。在缺失11aa的S1-IN片段之后剩余的137-aa的S1-Ic片段仍然表现出自发的C-cleavage活性。在进一步缩短S1-Ic片段的实验中发现,Ssp DnaXmini-intein在缺失N端15个氨基酸残基即整个Motif A之后仍然有C-cleavage活性。同时我们突变了137-aa的S4-Ic片段block B中的两个保守氨基酸残基His和Thr,结果发现将Thr突变为Ala之后其C-cleavage活性被大大抑制。这些结果表明了一个具有强生命力intein的发现,同时表明Block B中的Thr在intein的第三步剪接反应中可能发挥了很大的作用,这一部分结果在第五章中有详细讨论。利用断裂蛋白内含子的反式剪接可以将进行多肽片段连接,蛋白环化,NMR片段标记,基因治疗以及蛋白标记,蛋白修饰等。在第六章中我们利用蛋白质内含子反式剪接开劈了一条新途径,将三个具有高剪接活性的SO型断裂蛋白内含子Rma DnaB, Ssp GyrB和Ter DnaE-3的N端和C端剪接区域分别与蜘蛛丝基因的编码序列融合表达,以大肠杆菌为表达宿主,融合蛋白表达纯化后通过体外剪接得到分子量为256kDa的重组蜘蛛丝蛋白,克服了大肠杆菌不能表达高分子量蛋白的缺点。我们还利用定向进化得到的具有高剪接活性的Ssp GryB intein来剪接蓖麻毒素蛋白的A链(RicinA)。将RicinA断裂成两个没有功能的片段,在断裂位点处分别插入SspGyrB intein的野生型和四个突变型,筛选出具有高剪接活性的mini-intein,然后将其断裂为S11 split-intein,并在大肠杆菌内表达纯化和进行体外剪接,得到剪接产物,目前剪接效率只有约50%。因此,下一步的目标是提高剪接效率,并将融合基因分别克隆到病毒载体上,通过病毒颗粒包装,具有特异性导向性的病毒颗粒将携带这两段融合基因通过特异性抗原抗体识别进入癌细胞,在癌细胞内表达融合蛋白,通过蛋白质反式剪接将两个无活性的蓖麻毒蛋白片段连接起来形成完整的RicinA蛋白,杀死癌细胞。本论文主要涉及mini-intein保守位点1和+1位氨基酸残基的研究,S1和S11 split-intein的断裂研究,Ssp DnaX的自发C-cleavage研究以及断裂蛋白内含子的反式剪接技术的应用,不仅从机理上增加了人们对intein的认识同时还为intein的应用开辟了新途径。