广州管圆线虫[Angiostrongylus cantonesis(Chen，1935)Doughert，1946]寄生于人体时引起嗜酸性粒细胞增多性脑膜脑炎或脑膜炎(Eosinophilic meningitis or meningoencephalitis,EM)，是一种人兽共患食源性寄生虫病。近年来广州管圆线虫病的流行已经由太平洋沿岸地区而波及美国、欧洲、澳大利亚等地区，我国的福建、台湾以及其它地区曾发生了多次暴发流行。因此广州管圆线虫病也引起了我国的广泛的重视，2003年卫生部将其列为新发传染病。广州管圆线虫寄生于多种鼠类的肺动脉内，一期幼虫随宿主粪便一起排出体外，当被吞入或主动侵入中间宿主(螺类和蛞蝓等)体内后，在组织中发育为第二及第三期幼虫，人因生食或半生食含本虫幼虫的中间宿主或转续宿主而感染。 广州管圆线虫对人体的侵害主要累及中枢神经系统，病情严重危害较大，如不及时治疗可引起严重后果甚至死亡。由于该病的临床表现与神经系统病变类似，不易鉴别，确诊需要在脑脊液中查找到病原体，而临床上虫体检获率又很低，所以漏诊、误诊的可能性很大，对患者的预后造成很大的不利影响。所以，研究广州管圆线虫病的早期诊断、准确诊断方法是非常必要的。 现有的诊断方法中，血清学检测抗体是研究最多的，但是由于大多寄生虫病在发病一周后才能检测到抗体，三到四周左右抗体水平达到高峰，故在临床上不能起到及时、早期诊断的作用；近年来随着分子生物学的发展，PCR技术应用越来越广泛，在疾病诊断中也得到了一定的认可，但是该方法难以在基层使用，且假阳性率较高；抗原检测方法则可以早于抗体检测做出诊断，特别是抗体库技术的出现，为抗体的制备提供了一条较为理想的途径，也给广州管圆线虫病的早期诊断提供了新的思路。如何制备可用于检测抗原的抗体，是我们需要研究的关键问题。最初用多克隆抗体检测循环抗原，其敏感性和特异性均不够理想。后来，使用单克隆抗体检测抗原，并在此基础上对检测方法进行优化，经实验室研究和现场初步应用，均取得了较好的效果。通常用杂交瘤制备单克隆抗体，操作过程复杂，费时费力，产量有限，不易大规模制备，而且杂交瘤细胞传代过程中不稳定，这些不利条件限制了其广泛应用。近些年来，噬菌体表面呈现技术(Phage Display Techniques,PDT)发展迅速，也成为了抗体工程领域的重大进展。该技术将抗体基因型和表型统一于一体，将选择能力和扩增能力偶联起来，能够在体外模拟体内抗体生成过程。与杂交瘤技术相比，具有制备简便、筛选容量大、生产成本低、可以发酵生产大量制备等优点，同时克服了随机组合文库的筛选工作量大、筛选概率低、不易获得特异性抗体的缺点，在特异抗体的筛选和制备上独具优势，所以这一技术从出现到至今，已在感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤的诊断、防治以及抗原表位分析以指导疫苗分子的设计、抗独特型疫苗的构建、新型药物的设计等多个领域显示出巨大的潜能和广阔的应用前景。噬菌体抗体库技术的出现，为广州管圆线虫病的早期诊断提供了一条新的思路，如果能够将其应用在抗原检测中，必将给该病的早期诊断带来质的飞跃。 研究目的：本研究采用噬菌体抗体库这一新兴的生物学技术，首次以广州管圆线虫感染的小鼠脾细胞为源，构建抗广州管圆线虫抗体库，目的是从中筛选出可用于广州管圆线虫病早期诊断的目的抗体，为研制广州管圆线虫病的快速诊断试剂盒奠定基础。 研究方法：从感染广州管圆线虫小鼠的脾细胞中提取RNA，经逆转录、PCR扩增出抗体轻链和重链基因，将轻链基因和表达载体pComb3进行酶切、连接、转化大肠杆菌XLI-Blue，构建轻链库；再对轻链重组质粒和重链Fd基因进行酶切、连接，转化大肠杆菌XLI-Blue，构建组合文库，以辅助噬菌体VCSM13进行超感染，在此基础上，用广州管圆线虫排泄分泌抗原(EsAg)作为筛选抗原，进行四轮“吸附-洗脱-扩增”富集筛选，在最后一次富集后，将洗脱下来的噬菌体感染细菌铺盘，随机挑取50个菌落，用ELISA法进行阳性克隆的鉴定。结果成功构建了库容为2.32x106的鼠源性抗广州管圆线虫噬菌体Fab段抗体库。经过四轮“吸附-洗脱-扩增”富集筛选，抗体库中目的抗体得以富集130倍，用ELISA法对它们进行鉴定，获得了5株阳性克隆。 上述结果表明，我们已成功构建了以感染小鼠的脾细胞为源的抗广州管圆线虫噬菌体抗体库，库容为2.32x106，滴度为1.7×1013cfu／ml，基本上达到了建库的要求，并从中筛选到了抗广州管圆线虫循环抗原的特异性抗体克隆，用过氧化物酶标记的抗M13抗体进行初步鉴定，认为具有一定的特异性。构建的抗广州管圆线虫抗体库也为广州管圆线虫抗原表位或有效疫苗表位的筛选及该病的抗体治疗提供了库源。