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目的:本实验采用免疫共沉淀证实Mcl-1蛋白与HSP90蛋白存在相互作用,而具体结合位点不明,因此本研究目的在于构建不同Mcl-1缺失突变体载体,为后续探讨具体结合位点的研究提供基础。方法:1.通过细胞培养、蛋白提取、免疫共沉淀、western blot验证Mcl-1基因与Hsp90基因表达的蛋白是否存在相互作用;2.搜索NCBI基因库中Mcl-1的基因序列,根据Mcl-1的蛋白结构(含CHT、BH1、BH2、BH3、PEST 5个结构域),利用NCBI基因库中Mcl-1相关CDs序列及蛋白氨基酸序列顺序,用NCBI中的Premier-Blast设计引物,并用Standard Nucleotide Blast鉴定引物,由上海远见生物公司合成引物;以Mcl-1全系列载体pcDNA3.1Mcl-1为模板,采用反向PCR的方法,经限制性内切酶消化、目的DNA回收、目的DNA连接环化、PCR扩增等步骤分别扩增五个结构域缺失的Mcl-1缺失突变体载体;3.经制备琼脂糖凝胶、制备胶板、加样、电泳等步骤对反向PCR扩增出的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳进行鉴定;4.利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收反向PCR扩增出的野生型Mcl-1序列、Mcl-1-ΔBH1序列、Mcl-1-ΔBH2序列、Mcl-1-ΔBH3序列、Mcl-1-ΔPEST序列、Mcl-1-ΔCHT序列,以回收的DNA经目的片段酶切、载体酶切、载体连接、转化等步骤构建不同结构域缺失的pcDNA3.1/Mcl-1/HA缺失突变体载体;5.对构建好的不同结构域缺失的Mcl-1突变体载体经质粒抽提、双酶切鉴定及测序分析,以最终证实构建的缺失突变体载体是否构建成功。结果:1.免疫共沉淀实验发现,Mcl-1的抗体可沉淀Hsp90,用Hsp90的抗体也可以沉淀Mcl-1,说明在细胞内Mcl-1与Hsp90存在相互作用。2.按照上述方法设计并合成引物,得出最终引物序列;3.利用琼脂糖凝胶电泳对Mcl-1各结构域缺失突变体反向PCR扩增结果进行电泳鉴定可观察到6条约5kb左右大小清晰的特异性条带,与预计的DNA片段大小相符;4.运用双酶切法鉴定对Mcl-1各结构域缺失突变体HA真核表达质粒酶切鉴定证实重组的缺失突变体载体构建正确;对构建的缺失突变体载体进行测序分析,与NCBI中的测序结果进行比对证实结果5个缺失突变体编码基因均分别被正确插入pcDNA3.1/HA表达载体中,即不同结构域Mcl-1缺失突变体载体构建成功。结论:1.Mcl-1与Hsp90存在相互作用;2.以pcDNA3.1-Mcl-1为模板,通过反向PCR扩增方法获得了Mcl-1五个不同结构域缺失突变体;3.通过对Mcl-1各结构域缺失突变体重组质粒进行酶切鉴定和序列分析,结果证实5个缺失突变体编码基因均被正确插入pcDNA3.1表达载体中,表明构建了5个不同结构域缺失的Mcl-1缺失突变体载体;4.通过五个Mcl-1结构域缺失突变体HA真核表达载体,为进行进一步实验探讨Mcl-1与Hsp90相互作用位点提供基础。