论文部分内容阅读
实验目的探讨大鼠脂肪干细胞（Adipose derived stem cells,ADSCs）的分离、培养、扩增及表型鉴定方法。研究应用TGF-β1基因转染大鼠ADSCs,诱导其向软骨细胞分化,比较目的基因的分泌情况及向软骨细胞分化效果,为软骨组织工程学种子细胞提供新方法。实验方法先行质粒pcDNA3.1（+）-TGF-β1扩增、提取和酶切鉴定。取大鼠大网膜及肾周脂肪囊等处脂肪组织,眼科剪剪碎,加入3倍体积0.1%的Ⅰ型胶原酶,酶消化法及密度梯度离心法相结合,分离、纯化SD大鼠ADSCs,倒置显微镜观察培养各代ADSCs的形态。取第3代脂肪干细胞,免疫荧光法检测其表面抗原CD29、CD44、CD106、CD34表达。将TGF-β1基因转染ADSCs,按转染情况分为4组:未转染组（A组）、转染空载体组（B组）、转染TGF-β1组（C组）、转染TGF-β1组（D组）。对转染后细胞进行筛选,MTT法测定筛选后细胞的增殖活性,RT-PCR检测TGF-β1、SOX9、Aggrecan和CollagenⅡ（Col-Ⅱ）mRNA表达,Western blot检测TGF-β1、Coll-Ⅱ蛋白表达。实验结果1、TGF-β1质粒鉴定测序结果与GenBank基因序列相符。2、原代培养的脂肪干细胞1d即可在培养皿内见细胞贴壁,贴壁细胞呈类圆形;2d后长梭形细胞逐渐增多;4-5d后细胞呈典型团簇状生长,形成集落;约7d左右细胞融合超过90%时;3代后细胞形态比较均一,呈大长梭形。3、大鼠ADSCs的鉴定免疫荧光法检测ADSCs CD44、CD29呈阳性反应,CD106、CD34呈阴性反应。4、MTT法检测转染基因对ADSCs增殖活性的影响C、D组的吸光度值明显高于A、B组,与A、B组之间的差异具有显著性（P＜0.01）,而C组和D组、A组和B组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。5、RT-PCR检测TGF-β1、SOX9、Aggrecan、Coll-ⅡmRNA表达mRNA显示C、D组TGF-β1、SOX9、Coll-Ⅱ、和Aggrecan的mRNA表达增强。除TGF-β1在A、B组表达外（A、B组比较P＞0.05）,余下各检测指标在未转染组和转染转空载体组均未见表达。6、Western blot检测TGF-β1、Coll-Ⅱ蛋白表达C、D组的TGF-β1、Coll-Ⅱ的蛋白表达高于A、B组,差异具有显著性（P＜0.01）,A、B组间的差异无统计学意义（P＞0.05）。结论大鼠ADSCs经分离,纯化,扩增,生物学性状稳定。ADSCs能稳定地表达CD29、CD44,CD106、CD34表达阴性,证明其为干细胞来源。转染TGF-β1后ADSCs细胞的增殖能力增强。稳定转染TGF-β1后的ADSCs能够持续表达和分泌TGF-β1基因和蛋白。转染TGF-β1基因后的ADSCs成功表达软骨细胞的特异性基质,具有了软骨细胞的生化特征。采用脂质体作为载体,安全、无毒副作用,经基因修饰过的ADSCs携带了诱导其向软骨细胞分化,促进基质分泌的细胞因子的基因,因此,经TGF-β1基因修饰的ADSCs可以作为软骨组织工程的种子细胞来源。