研究背景：青少年特发性脊柱侧凸(AIS)是一种伴有侧方弯曲和椎体旋转的三维脊柱畸形。约有(1-3)%10-16岁的孩子受AIS的影响,但其真正病因尚未可知。最近,针对AIS病因的研究集中在基因、脊柱生长发育、神经系统、褪黑素、椎旁肌、结缔组织、骨质疏松、血小板等方面。但是AIS特定的发病年龄和特殊的生长发育特征表明其产生和发展与生长发育有着肯定的联系。在几种生长发育异常理论中,脊柱相对过快生长看起来更容易被接受。Murray等认为前柱相对于后柱的过快生长可以解释脊柱侧凸复杂的生物力学机制,并可以为多科病因诱导AIS产生提供最后共同通路。Guo等发现AIS患者有更高的T1-T12椎体并把椎体的过度纵向生长归因于过快的软骨内成骨,Zhu等将AIS患者顶椎区的椎体生长板与先天性脊柱侧凸患者正常的生长板进行对比发现AIS患者的椎体生长板高度和生长动力学指标要高。但是针对AIS患者椎体生长板的异常生长机制还没有相关研究。椎体生长板介于椎体骨性结构和椎间盘组织之间。像长骨生长板一样,椎体生长板由肥大层、增殖层、静止层这三层构成,椎体生长板在脊柱的纵向生长中起到重要作用。文献表明,纵向骨生长是软骨内骨化的结果,而软骨内骨化实质上就是由软骨细胞转变为骨的一种过程。因此研究AIS椎体生长板软骨细胞的异常增殖、分化可能是揭示AIS病因的有效途径。AIS发生在生长发育高峰期,而此期间正是激素变化很快的时期,考虑到AIS的高发病率(1%-3%),我们认为激素失衡可能是AIS的根本发病机制。众所周知下丘脑-垂体-激素轴的激活是青春期内分泌变化的核心,作为生长发育的一部分,椎体生长板的软骨内骨化肯定也受到下丘脑-垂体-激素轴的调节。很明显,阐明下丘脑-垂体-激素轴对椎体生长板软骨细胞异常增殖、分化的影响可能是发现AIS病因的关键途径。褪黑素是一种由松果体分泌作用广泛的激素。许多研究者发现褪黑素与哺乳动物和人脊柱侧凸的产生有着密切的关系。Machida和其他研究者发现松果体切除的鸡、双足鼠、仓鼠可出现脊柱侧凸,并且Machida还发现中度侧凸AIS患者给予褪黑素可以阻止侧凸进展。所以,有些研究者认为动物或人脊柱侧凸的产生与褪黑素的减少有关。但不是所有松果体切除的动物均产生脊柱侧凸,AIS患者亦没有褪黑素产生等方面的障碍,患有与褪黑素异常相关疾病的患者也没有明显的脊柱侧凸出现,所以Weinstein等推测脊柱侧凸不像是单纯褪黑素缺乏所致,可能是褪黑素对其他未知生长机制影响的结果。已知雌激素和生长激素可以影响纵向骨生长并且这两种激素是下丘脑-垂体-激素轴的重要组成部分,并且雌激素与AIS的产生有着紧密联系。作为一种作用广泛的激素,褪黑素与下丘脑-垂体-激素轴密切相关,并且褪黑素可以阻断雌激素受体并且可以刺激生长激素的释放。基于以上事实,我们推测褪黑素可能通过影响下丘脑-垂体-激素轴和椎体生长板内软骨细胞的增殖、分化而在AIS的发病中产生重要作用。2009年有学者发现褪黑素可以促进猪关节软骨细胞合成基质增加,表明褪黑素可以影响软骨细胞,但其与椎体生长板软骨细胞的关系还未见报道。由于受到椎体生长板取材及医学伦理学的限制,对AIS患者及正常人椎体整个生长板的研究很难实现,所以我们从动物实验入手,首先探讨褪黑素对大鼠椎体生长板软骨细胞的影响及机制。研究目的：1.建立体外培养及鉴定大鼠椎体生长板软骨细胞的方法,观察软骨细胞的传代特征。2.比较不同年龄大鼠胸椎椎体生长板的组织学差异并对不同年龄大鼠椎体生长板软骨细胞的增殖能力进行测定。3.探讨大鼠脊柱椎体生长板中是否有褪黑素受体的表达。4.初步探讨褪黑素对体外培养大鼠椎体生长板软骨细胞的影响及机制。研究方法：1.大鼠椎体生长板软骨细胞的分离、培养与鉴定。(1)、大鼠椎体生长板软骨细胞的分离与培养：采用改良胰酶和Ⅱ型胶原酶序贯消化法分离、培养大鼠椎体生长板软骨细胞。椎体生长板从4只1周龄的SD大鼠获得。将椎体生长板用无菌PBS冲洗3次,0.25%胰酶消化30min,接着用0.2%Ⅱ型胶原酶消化1h,去除组织残渣后将椎体生长板剪成1mm3大小,再用0.2%Ⅱ型胶原酶消化5h。收集细胞,用含10%胎牛血清和双抗(100 U/ml青霉素和100U/ml链霉素)的DMEM培养基在含有5% CO2湿润的37℃培养箱中进行细胞培养。培养基隔日换液,细胞长满时采用0.25%胰酶进行消化传代。随后的实验中采用传1-3代的细胞。(2)、大鼠椎体生长板软骨细胞的鉴定：原代细胞传代后采用倒置相差显微镜下观察、细胞HE染色和甲苯胺蓝染色对软骨细胞进行鉴定,采用MTT比色法绘制细胞生长曲线。(3)、软骨细胞传代特征的观察：将细胞传代至第6代,采用倒置相差显微镜观察各代软骨细胞的形态,采用免疫细胞化学染色鉴定各代软骨细胞Ⅱ型胶原的表达。2.不同年龄大鼠胸椎椎体生长板的组织学观察及增殖能力测定。(1)、不同年龄大鼠胸椎椎体生长板的组织学观察。采用番红0-固绿染色法对1天、1周、4周、8周、16周、28周龄大鼠胸椎椎体生长板进行染色鉴定,测定生长板软骨肥大区、增殖区、静止区的高度。(2)、不同年龄大鼠胸椎椎体生长板的增殖能力测定。采用改良的胰酶和Ⅱ型胶原酶序贯消化法对以上年龄阶段大鼠胸椎椎体生长板软骨细胞进行原代培养。采用实时定量PCR检测不同年龄大鼠胸椎椎体生长板体外培养软骨细胞增殖细胞核抗原(PCNA)的基因表达水平,采用Western blot法测定不同年龄大鼠胸椎椎体生长板体外培养软骨细胞PCNA蛋白的表达。3.大鼠椎体生长板褪黑素受体的测定(1)、免疫细胞化学染色测定生长板软骨细胞褪黑素受体。取1周大鼠椎体生长板进行软骨细胞原代培养,传代后通过免疫细胞化学染色测定椎体生长板软骨细胞中褪黑素受体(MT1,MT2)的表达。(2)、免疫组织化学染色测定大鼠椎体生长板褪黑素受体。取1天SD大鼠的椎体生长板组织进行褪黑素受体免疫组化染色,检测椎体生长板组织中褪黑素受体(MT1,MT2)的表达。(3)、褪黑素受体基因的测定。通过RT-PCR检测褪黑素两种受体(MT1,MT2)基因的表达。(4)、褪黑素受体蛋白的测定。采用Western blot法测定褪黑素受体(MT1,MT2)蛋白的表达。4.褪黑素对体外培养生长板软骨细胞增殖、分化影响的检测(1)、褪黑素对椎体生长板软骨细胞增殖影响的检测。将不同浓度(0,0.1,1,10和100μg/ml)的褪黑素加到培养基里对软骨细胞进行刺激。褪黑素对细胞增殖的影响采用阿尔玛蓝测定法进行检测,简言之,将软骨细胞接种至96孔板并培养48h,将阿尔玛蓝以10%的体积百分比加至培养基中并在培养箱中培养5h,采用分光光度计测量590nm时的吸光度。(2)、与软骨细胞增殖、分化相关因子的检测。将不同浓度(0,0.1,1,10和100μg/ml)的褪黑素加到培养基里对软骨细胞进行刺激。采用Western blot法检测PCNA (反映细胞的增殖潜能)、Sox9(控制细胞分化的核心转录因子)、Smad4(调节软骨细胞增殖、分化的共同调节子)蛋白的表达。结果：1.大鼠椎体生长板软骨细胞的分离、培养与鉴定。(1)、大鼠椎体生长板软骨细胞的分离与培养：1周龄SD大鼠的椎体生长板约2mm×1mm×0.5mm大小。软骨细胞接种6h后开始贴壁,接种24h后所有细胞贴壁完成,细胞长满后呈“铺路石”状外观。MTT比色法显示,传3代以前的软骨细胞的生长曲线近似“S”形,从第4天开始细胞呈对数生长,第9天达平台期,至第11天开始出现生长抑制。(2)、大鼠椎体生长板软骨细胞的鉴定：倒置相差显微镜下观察和HE染色显示细胞基本形态为多边形,胞浆丰富,胞核较圆；甲苯胺蓝染色见胞核蓝染；以上的描述均符合软骨细胞的形态特征。(3)、软骨细胞传代特征的观察：体外培养的软骨细胞随着传代次数的增加,细胞形态由原代的多角形逐渐变为长梭形,传4代后细胞有成纤维化的趋势。ⅡⅡ型胶原免疫细胞化学染色示传3代以前的软骨细胞呈强阳性,随着传代次数的增加软骨细胞1Ⅱ型胶原的表达逐渐降低。2.不同年龄大鼠胸椎椎体生长板的组织学观察及增殖能力测定(1)、番红O-固绿染色。1天、1周、4周、8周、16周、28周龄大鼠椎体生长板番红O-固绿染色可见生长板软骨组织被染成红色。16周大鼠椎体生长板静止区内开始有骨长入,28周龄大鼠椎体生长板仍然存在但静止区大部分出现骨化现象。(2)、不同年龄大鼠胸椎椎体生长板各区高度的测量。1天及1周大鼠肥大区明显高于其他年龄组(P<0.01)；1天及1周大鼠增殖区高于其他年龄组(P<0.05),4周大鼠增殖区高于28周大鼠(P<0.05)；1天及1周大鼠静止区高于其他年龄组(P<0.05),4周大鼠静止区高于16周、28周大鼠(P<0.05)。(3)、不同年龄大鼠胸椎椎体生长板的增殖能力测定。PCNA基因的相对表达量随年龄增加而降低；与1天大鼠相比,剩余各组PCNA基因的表达与之的差异均有显著统计学意义(P<0.01)。PCNA蛋白的相对表达量随年龄增加而减少；与1天大鼠相比,剩余各组PCNA蛋白的表达与之的差异均有显著统计学意义(P<0.01)。3.大鼠椎体生长板褪黑素受体的测定(1)、免疫细胞化学染色测定生长板软骨细胞褪黑素受体。大鼠椎体生长板软骨细胞褪黑素受体免疫细胞化学染色显示软骨细胞被染成棕黄色。(2)、免疫组织化学染色测定大鼠椎体生长板褪黑素受体。1天大鼠椎体生长板褪黑素受体免疫组化染色示生长板各层内软骨细胞均被染成棕黄色。(3)、褪黑素受体基因的测定。与内参基因GAPDH相比,褪黑素受体(MT1,MT2)在椎体生长板软骨细胞中的基因相对表达量分别为0.11±0.02、0.05±0.01。(4)、褪黑素受体蛋白的测定。与内参β-actin相比,褪黑素受体(MT1,MT2)的蛋白相对表达量分别为0.28±0.11、0.22±0.09。4.褪黑素对体外培养生长板软骨细胞增殖、分化影响的检测(1)、褪黑素对体外培养生长板软骨细胞增殖影响的检测。10和100μg/ml的褪黑素显著抑制传代椎体生长板软骨细胞的增殖；褪黑素的溶剂(乙醇)对细胞的增殖无明显影响：褪黑素的增殖抑制效应可被褪黑素受体拮抗剂luzindole拮抗。(2)、与软骨细胞增殖、分化相关因子的检测。随着褪黑素浓度增高,PCNA、Sox9和Smad4的表达水平降低。结论：1.改良序贯酶消化法能成功分离和培养大鼠椎体生长板软骨细胞,能在短时间内获得高纯度的软骨细胞,传3代及3代以内的细胞具有软骨细胞的特征性表型,增殖较快。2.1天及1周大鼠椎体生长板各区的高度明显高于年龄较大的大鼠。16周大鼠椎体生长板静止区内开始有骨长入,28周龄大鼠椎体生长板仍然存在但静止区大部分出现骨化现象。随年龄增加椎体生长板软骨细胞的增殖能力逐渐下降。3.大鼠椎体生长板存在褪黑素受体(MT1,MT2)的表达,预示褪黑素可能对脊柱的纵向生长存在一定影响。4.高浓度褪黑素可以抑制椎体生长板软骨细胞的增殖和分化。