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茶树(Camellia sinensis)是一种重要的经济作物,它的经济价值不仅体现在茶叶上,茶树花、果实也有很高的经济价值。茶被誉为“世界三大无酒精饮料之一”,现已成为世界上流行的保健饮品。随着生物技术的发展与应用,关于茶树的科学研究已经逐渐深入至分子生物学水平,茶树基因的分离与克隆已成为分子生物学研究的重要内容。本课题是与安徽农业大学茶树生物学与资源利用国家重点实验室合作完成,以茶树品种“舒茶早”植株为材料构建茶树BAC(bacterial artificial chromosome)文库。该文库含有161,280个克隆,保存在420块384板中。随机挑选450个BAC克隆检测DNA插入片段,片段大小集中在100~130 kb之间,平均插入片段约为113 kb,空载率小于2.5%,以茶树基因组2.9 Gb计算,该文库大约覆盖整个茶树基因组6.2倍。随机挑选48个BAC克隆测BAC末端序列,参考NCBI数据库中茶树细胞器基因组序列信息,对BAC末端序列进行比对。Blastn分析表明随机挑选的48个克隆中没有检测到细胞器污染的克隆存在。建立高效率的2步PCR筛选基因的方法对“舒茶早”茶树BAC文库进行筛选,获得7个含有茶树功能基因(Csi092H17、Csi020O15、Csi044B12、Csi274K14、Csi271P8、Csi106D7、Csi047O18)的BAC克隆。首先构建420个一级混合池用于第一轮PCR筛选,随后对第一轮PCR筛选出的384板构建行池和列池,用于第二轮PCR筛选。筛选出这些基因的BAC克隆后,再挑选5个BAC克隆(分别包含Csi092H17,Csi020O15,Csi044B12,Csi271P8,Csi106D7基因)构建shotgun文库,进行鸟枪法(shotgun)测定BAC克隆序列。通过测序、组装、拼接及补平缺口得到其全长序列,拼装后的序列供安徽农业大学茶树生物学与资源利用国家重点实验室分析使用。