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甘草黄酮是甘草中一种重要的活性成分,它的含量直接影响甘草的品质。大量研究表明,黄酮类化合物具有抗病毒、抗氧化、抗癌、抗菌、清除自由基等多种生物学活性和药理学效果。植物中黄酮类化合物的生物合成是来自于苯丙烷代谢途径。MYB转录因子是植物中最大的转录因子家族之一,在植物的生长和发育过程中起着重要的作用,是调控黄酮类化合物合成的主要转录因子家族。其中,R2R3-MYB是植物中MYB转录因子最多的一类。MYB基因的表达明显受外界环境刺激所诱导,如信号分子茉莉酸等。茉莉酸甲酯是一种植物内源生长调节物质,可诱导激活茉莉酸信号通路,参与调控次生代谢物(尤其黄酮类化合物)的合成。实验室前期研究发现,外源施加茉莉酸甲酯,甘草细胞中黄酮类化合物的合成明显增加,并且通过转录组分析筛选出11个差异表达明显的MYB转录因子。本实验以乌拉尔甘草为研究对象,克隆出2个R2R3型的MYB类转录因子。通过对GlMYBs进行生物信息学分析、qPCR、亚细胞定位、过表达后黄酮类化合物检测,明确了GlMYBs是响应茉莉酸甲酯诱导调控甘草中黄酮类化合物合成的相关基因。主要结果如下:(1)GlMYB51、88基因的克隆及生物信息学分析:结果显示二者均属于R2R3-MYB类基因家族。(2)GlMYBs基因的时空表达模式分析:GlMYB51、88、84和4。为了测定GlMYBs在甘草植株不同组织器官和生长期的表达情况,选择2、3、4和5周龄的试管苗进行qPCR实验。结果表明GlMYBs的表达水平均在甘草根中较高,且GlMYBs基因的表达水平随着植株的生长而增高。(3)转录因子GlMYBs的亚细胞定位:构建重组质粒pJG054-GlMYBs,将重组质粒转化到农杆菌GV3101细胞。用转化后的农杆菌注射烟草叶片,60小时后激光共聚焦显微镜下观察。发现GlMYB88、84和4编码的蛋白定位于细胞核中。(4)GlMYBs基因功能的初步分析:在甘草细胞中过表达GlMYB88、84和4。结果显示,过表达组各GlMYBs的表达水平明显高于对照组,并且黄酮合成关键酶基因——C4H和CHS基因的表达水平明显高于对照组。用紫外分光光度法和高效液相色谱法测定了生长稳定的转基因细胞中总黄酮与黄酮单体——异甘草素的含量,发现过表达组二者均高于对照组,且GlMYB88转录因子作用明显。