蛋白质是生物体内的功能活动的主要执行者,许多人类疾病与蛋白质的异常聚集事件有着千丝万缕的联系,因此研究蛋白质的聚集及其相互作用对新药的发展显得尤为重要。近年来,利用原子力显微镜（atomic force microscopy,AFM）技术在单分子水平上理解生物分子间的相互作用已成为生物医学和分子生物学中重要的研究方法学。阿兹海默症（AD）患者大脑中β淀粉样蛋白（amyloid-βprotein,Aβ）的异常聚集是AD发生的主要病理特征,多项研究表明金属阳离子可能是Aβ异常聚集重要的环境诱导因素之一。然而现有的研究大多聚焦在荧光光谱、核磁共振等方法上,在单分子水平上开展Aβ与金属阳离子间相互作用研究鲜有报道。本文力图利用原子力学显微技术,从单分子力学行为视角,通过附着力和摩擦力等力谱技术角度,讨论金属阳离子对Aβ聚集的影响。主要开展以下几个方面的研究:（1）利用自组装单分子层法（SAMs）,制备16-巯基烷基酸（MHA）分子膜,并将Aβ42分子共价连接于经N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）-碳化二亚胺盐酸盐（EDC）活化后的MHA膜上,从而实现了Aβ42分子在金基底和镀金探针表面的固定,获得均一稳定的Aβ42单分子层。通过轻敲模式原子力显微镜（TM-AFM）、接触角（CA）、X射线光电子能谱（XPS）和掠入射X射线衍射（GIXRD）等方法对制备的单分子层进行表征,结果显示:1)从三维形貌图可见,空白金层、MHA膜层和Aβ42单分子层三个不同表面有着不同表面粗糙度和高度的差异性微结构。2)CA测试显示MHA膜和Aβ42单分子层均具有高亲水的表面;不同摩尔比的MHA/正十二烷基硫醇（NDM）混合硫醇分子膜表面,随着正十二硫醇所占的比例增大亲水性降低、接触角增大。3)空白金片、MHA膜和Aβ42单层的XPS结果表明各样品表面测得的元素组成均与对应膜层成分吻合。4)GIXRD测试结果进一步表明,相比空白金片,MHA膜和Aβ42单分子层的特征吸收峰均发生了明显变化,均在0¹5°的2θ角范围内有特征锋。（2）在液相环境下,利用TM-AFM对Aβ42聚集反应进行了成像研究,分别观察了不同条件下Aβ42分子层在24、48、72h的形貌特征,结果表明:空白及不同金属阳离子溶液条件下的Aβ42分子层表面微结构各不相同,金属阳离子存在时Aβ42分子层有明显的聚集特征,表现为分子层纳米结构以及表面粗糙度的变化。空白溶液中,随时间的增加,Aβ42分子层并无较大聚集特征颗粒出现;而金属离子存在条件下,Aβ42分子层表面形貌呈现出较大的聚集特征纳米颗粒。由形貌学的角度可见,金属阳离子对Aβ42分子间二聚化以及寡聚化反应的进行具有明显的促进作用。（3）利用AFM接触模式,对空白和不同金属阳离子溶液环境下Aβ42-Aβ42分子对的附着力（粘附力）行为进行了研究。采用泊松分布法计算Aβ42-Aβ42单分子对间粘附力,结果表明:对照实验（PBS溶液）中Aβ42-Aβ42单分子对间特异性相互作用力Fi为42±3 pN,而在Zn²⁺、Cu²⁺、Ca²⁺和Al3+存在条件下Fi分别增大至89±3pN、84±6pN、73±5pN、95±5pN;可见金属阳离子的存在显著增大了Aβ42分子间粘附力,由此可以推测Aβ42分子间粘附力的增大可能是诱导Aβ42分子间二聚化以及寡聚化的重要因素之一。（4）考察了不同金属阳离子浓度对Aβ42-Aβ42分子对间附着力影响的同时,讨论了不同p H条件下金属阳离子对Aβ42异常聚集的影响。结果表明:金属阳离子浓度的增加,在一定程度上促进了Aβ42-Aβ42间特异性相互作用。在1μM¹0μM浓度范围内,Aβ42-Aβ42特异性作用力Fi随金属阳离子浓度的增加而明显增大趋势,当金属阳离子浓度大于10μM时Fi的增加不再明显。不同pH条件下金属离子对Aβ42异常聚集的影响研究显示:当pH值大于5.0时,金属阳离子的存在是增大了Aβ42-Aβ42间特异性粘附力的,促进了Aβ42异常聚集的发生;而在pH小于5.0时则特异性粘附力大小接近对照组,形貌结果中也未观察到Zn²⁺的影响作用,由此可推论蛋白质质子化抑制了金属离子的作用。（5）在FFM（摩擦力学显微技术）研究中,利用Aβ42修饰的底层分子层与Aβ42修饰的探针分子层间的横向力操作模式,考察了不同金属离子溶液条件下Aβ42-Aβ42分子对间摩擦力学行为。结果显示,金属离子存在下,Aβ42-Aβ42分子层间摩擦力主要分布于150⁴00pN,空白对照组中摩擦力主要分布于50-150pN,表明金属离子的存在对Aβ42分子层间摩擦力有较大的影响。对MHA/NDM混合硫醇所组装的Aβ42分子层进行的摩擦力测试,结果表明:表面摩擦系数与表面粗糙度的变化趋势一致,因此表面成分和结构的改变是造成表面摩擦力差异的主要原因。对AFM测试中的法向加载力进行设定,结果表明:法向加载力在0-4.0nN范围内,Aβ42分子层间表面摩擦力与加载力呈线性相关关系。上述结果说明Aβ42分子层间的摩擦力变化与其聚集程度存在一定的相关性。（6）采用表面增强拉曼散射（SERS）跟踪金属阳离子作用于Aβ42前后的拉曼强度变化。对于Al3+而言,可见Aβ42的Amide II中位于1375cm-1处的拉曼峰大大减弱,几乎完全消失,1669cm-1处对应于β-折叠峰也相比空白对照组下降,表明Aβ42的分子中有相当一部分酰胺键与Al3+发生了相互作用,结构发生变化。另外,观察Aβ42单分子层中加入Zn²⁺与Cu²⁺的变化,可以很清楚的发现,两者促使Aβ42的构象变化所得谱图非常接近,两者中的的拉曼峰值强度比例（I1375/I1669）几乎相等,由此说明Zn²⁺、Cu²⁺与Aβ42的结合程度是非常相近的。而在加入Ca²⁺溶液条件下,相对于在生理溶液中的拉曼强度,其在含有Ca²⁺的溶液中β-折叠（1669cm-1）拉曼峰强减弱,但相比Zn²⁺、Cu²⁺而言Ca²⁺对Aβ42发生的β-折叠和酰胺键的构象转变程度最小,这一结果与原子力学显微技术所观察的结果相吻合。总之,本文从AFM的粘附力和摩擦力角度出发并借助SERS跟踪技术,讨论了Aβ42-Aβ42分子层间相互作用的力学行为,以及金属阳离子对这一作用的影响,从原子力学显微技术角度拓展了金属离子对Aβ异常聚集诱导假说的验证方法和手段。