论文部分内容阅读
目的:应用肝癌患者血清,从人肝癌组织构建的cDNA表达文库中克隆新的肝癌抗原基因,为寻找和鉴定新的肿瘤抗原探索一条新途径。方法:从人肝癌组织中抽提总RNA后磁珠法分离mRNA,以纯化的mRNA为模板,以含sfiⅠ酶切位点的oligo(dT)引物合成cDNA的第一链,利用SMART(Switching Mechanism At 5′end of RNATranscript)技术,经LD-PCR合成双链cDNA,该产物经蛋白酶K消化,sfiⅠ酶切后经Chroma spin-400柱分级分离,插入片段与λTripIEx2载体连接经体外包装成噬菌体cDNA文库。测定原始文库的滴度,进行蓝白筛选以确定文库重组率,并随机挑选克隆经PCR扩增鉴定插入片段的大小。最后将文库进行扩增并鉴定库容量。用人肝癌患者血清对肝癌组织cDNA文库进行免疫学筛选,阳性克隆经PCR检测鉴定后进行序列分析。结果:测定原始文库滴度为6.9×10~6pfu/ml,重组率为97.6%。原始文库扩增后,测定文库滴度为1.7×10~9pfu/ml,随机挑取45个克隆经PCR法鉴定插入片段的大小,插入片段介于0.5-2.0kb之间,平均长度为1.3kb。文库经三轮筛选后共获得7个阳性克隆,经PCR扩增后进行测序分析及相关数据库比对,分别代表了7个cDNA插入片段(抗原基因)。其中5个与已知基因高度同源,另外2个基因与GenBank中已知基因部分同源,其中有2个可能是新基因。结论:本实验成功构建了人肝癌组织的cDNA文库,文库质量较高,有利于以cDNA文库为基础的进一步的实验研究。用肝癌患者血清筛选文库,共得到7个肝癌相关抗原基因,其中有2个可能是新基因,它们与肝癌的相关性有待于进一步的研究证实。