第一部分RMP在肝脏恶性肿瘤中对自噬的调节依赖于p53的状态研究背景和目的肝脏恶性肿瘤(Hepatic malignancy)严重威胁着人类的健康。其中,肝癌(Liver cancer)是成人常见的肝脏恶性肿瘤,其发病率和死亡率均位于恶性肿瘤前十位。原发性肝癌(Primary liver cancer, PLC)最重要的病理类型是肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC),约70-85%为此类型。已经发现肝细胞癌与病毒感染、环境污染、遗传易感等多种因素相关,然而其发生发展的具体分子机制仍不清楚。目前对于肝癌的基础研究越来越深入,针对肝癌的治疗策略也越来越多样,其中手术切除是肝癌治疗最重要的方式。尽管临床对于肝癌的分类、分型和分期日趋完善,但肝癌的整体治疗效果难以令人满意,究其原因,肝癌异质性是导致治疗效果差强人意的主要原因。因此,研究肝癌发生发展的分子机制能够为更加细致的肝癌分类、分型提供分子基础。肝母细胞瘤(Hepatoblastoma, HB)是婴幼儿最常见的肝脏恶性肿瘤,约15%的肝母细胞瘤合并有遗传综合征,同时,多项研究发现肝母细胞瘤的发生发展与Wnt信号通路、Hedgehog信号通路等相关。因此,对肝母细胞瘤发生发展机制的研究有利于我们对于肝脏恶性肿瘤更加立体、更加细致的认识。自噬是细胞内保守的生物进程,其通过溶酶体途径降解细胞内的错误折叠蛋白,损伤的细胞器等,成为细胞内物质分解再利用的重要方式。然而,过度的自噬同样可以引起细胞死亡。自噬在肿瘤发生发展中的作用也呈双向性,不同肿瘤、不同背景中的研究结果截然不同。自噬既能抑制肿瘤发生,又能通过抑制p53的激活促进肿瘤发生；自噬既能通过对抗慢性炎症、组织损伤和基因组不稳定发挥抑制肿瘤发展的作用,又能为应激情况下肿瘤的生存发展提供必需的物质。在同一肿瘤、不同分子背景的肿瘤中,自噬也发挥着双向调节的作用。小鼠胰腺导管腺癌中的一项研究发现,在p53正常存在的情况下,自噬发挥促进肿瘤的作用,当敲除p53后,自噬发挥抑制肿瘤的作用。那么,在肝脏恶性肿瘤中,自噬究竟发挥怎样的调节作用呢?RMP (RNA polymerase subunit 5-mediating protein)是RNA聚合酶第5亚基的调节蛋白。已经发现,RMP在多种肿瘤组织中高表达,并通过诱导DNA损伤、抑制凋亡、促进转移等机制发挥促进肿瘤发生发展的作用。然而,RMP对肿瘤自噬的调节作用尚无相关研究。因此,我们以肝脏恶性肿瘤为研究对象,通过干扰RMP慢病毒建立稳转细胞系,在细胞水平检测了干扰RMP对肿瘤细胞自噬的影响。发现了RMP在不同背景肝脏恶性肿瘤细胞中对自噬的分化调节,并研究了这种分化调节可能额分子机制。研究方法1.收集肝母细胞瘤组织样品,分别使用Western blot和RT-PCR检测冰冻组织样品中RMP的蛋白水平和mRNA水平；使用免疫组织化学方法检测蜡块组织切片中RMP的表达。2.选择肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞和Huh6细胞,肝细胞癌细胞系SMMC7721细胞和Huh7细胞,分别用干扰RMP慢病毒构建稳转细胞系。CCK-8和EdU实验检测干扰RMP对肝母细胞瘤细胞增殖的影响。3.平板克隆实验检测干扰RMP对肝母细胞瘤细胞克隆形成的影响。4.使用SA-β-gal染色实验以及细胞免疫免疫荧光检测γ-H2AX的表达,检测干扰RMP对肝母细胞瘤细胞衰老的影响。5.检测自噬溶酶体途径直接底物p62的蛋白水平,反映干扰RMP对肝脏肿瘤细胞自噬的影响。6.检测对照组细胞和干扰RMP细胞中衰老相关分子的表达。因为p53对细胞增殖、衰老等呈单向调节,而对自噬调节呈双向调节,选择p53作为此项研究的兴趣分子。7.使用CHX抑制翻译检测p53半衰期,使用DNA损伤性药物Dox检测p53的活性,研究肝脏恶性肿瘤细胞中p53的状态。8.使用过表达RMP质粒瞬时转染肝脏恶性肿瘤细胞,Western blot检测p53蛋白。进一步验证RMP对p53蛋白的调节作用。9.使用免疫共沉淀检测MDM2与p53结合的能力。10.使用免疫共沉淀检测p53与泛素分子UB的结合能力,反映p53的泛素化及总蛋白泛素化。11.使用RT-PCR检测p53下游靶基因的表达,使用胞浆胞核分离技术检测干扰RMP后,细胞各组分中p53蛋白的变化。研究结果1.RMP在肝母细胞瘤组织中的表达：肝母细胞瘤冰冻组织和石蜡包块组织中,RMP均高表达。2.RMP对肝母细胞瘤细胞增殖的影响：干扰RMP能明显抑制肝母细胞瘤细胞HepG2和Huh6的增殖能力。3.RMP对肝母细胞瘤细胞克隆形成的影响：干扰RMP能明显抑制肝母细胞瘤细胞HepG2和Huh6的克隆形成能力。4-RMP对肝母细胞瘤细胞衰老的影响：干扰RMP能促进肝母细胞瘤细胞HepG2和Huh6发生衰老。5.RMP对肝脏恶性肿瘤细胞自噬的影响：在HepG2细胞和SMMC7721细胞中,干扰RMP抑制自噬；在Huh6细胞和Huh7细胞中,干扰RMP促进自噬。6.RMP对衰老相关分子的调节：干扰RMP明显上调衰老相关分子p16、p53、p21的表达。7.不同肝脏恶性肿瘤细胞中p53的状态：HepG2细胞和SMMC7721细胞中的野生型p53半衰期约20-30分钟,能够被Dox激活；Huh6细胞和Huh7细胞中突变型p53半衰期约6-8小时,Dox刺激下蛋白不上调。8.RMP对p53蛋白的调节：过表达RMP能够明显下调p53蛋白。9.RMP对MDM2与p53结合能力的影响：干扰RMP,MDM2与p53的结合明显减少。10.RMP对p53蛋白泛素化和总蛋白泛素化的影响：干扰RMP,明显减少p53蛋白泛素化和总蛋白泛素化。因此,RMP通过影响p53泛素化,调节p53的蛋白稳定性。11.RMP通过对p53蛋白的调节影响自噬：干扰RMP所诱导的p53蛋白并不影响下游靶基因的表达。干扰RMP主要引起胞浆中野生型p53蛋白升高,进而发挥抑制自噬的作用。结论本研究发现RMP在肝母细胞瘤组织中高表达。细胞实验发现RMP促进了肝母细胞瘤细胞的增殖、克隆形成,并抑制细胞衰老,然而RMP对细胞自噬的调节呈现双向性。进一步研究发现,RMP能明显抑制p53蛋白表达。机制研究发现,RMP通过促进MDM2与p53的结合从而促进了p53蛋白泛素蛋白酶体途径的降解。同时,我们发现RMP对p53蛋白的调节并不影响其下游靶基因的表达,胞浆胞核分离实验发现RMP主要减少了胞浆中基础p53,进而促进细胞自噬。第二部分p53的状态决定了自噬对蛋白酶体抑制剂所诱导的凋亡的调节作用研究背景和目的自噬是依赖于溶酶体的细胞内物质的降解通路。一方面,它能将细胞内不需要的组分降解生成细胞必须的营养成分,从而实现了细胞内物质的再利用；另一方面,当自噬过度激活时,细胞也能被这种“自我消化”式的降解途径所损伤,引起细胞死亡。与此同时,自噬与其他引起细胞死亡的方式之间也存在非常重要的联系。自噬对于凋亡的调节因研究的背景不同呈现明显的分化。一部分研究发现,自噬能够通过特异性地降解促凋亡分子如Caspase8等发挥抑制凋亡的作用；而自噬的特殊类型线粒体自噬还可以通过清除受损的线粒体,减少内源性促凋亡因子的释放,抑制内源性凋亡通路。然而,另一部分研究发现,自噬相关基因能够与Caspase8结合,促进Caspase8的活化；同时,自噬也能特异性降解内源性自噬抑制分子,这些机制均表明自噬能够促进凋亡。因此,自噬对凋亡的调节作用完全取决于上下文关系。不同研究中细胞的分子背景不同,可能是引起这种“相互矛盾”结果的原因之一。p53是重要的抑癌基因,它在细胞凋亡和自噬的调节中均发挥重要作用。活化的p53在胞核中作为转录因子,能转录激活多种促凋亡靶基因；而胞浆中活化的p53能够在线粒体与多种促凋亡分子、抑制凋亡分子相互作用,最终促进细胞凋亡。p53对自噬调节也因研究背景的不同而呈现双向性,之前的研究认为,活化的p53在胞核中能够激活促自噬相关分子的转录,然而最近的研究发现,持续的DNA损伤能够诱导p53转录激活自噬抑制分子FBXL20;胞浆中非活化的p53通过抑制自噬小体的形成发挥抑制自噬的作用。因此,我们猜想p53在自噬对凋亡的双重调节中可能发挥重要的作用。泛素蛋白酶体途径是细胞内另一个重要的细胞内物质降解通路,而蛋白酶体抑制剂能在多种肿瘤细胞中引起自噬和凋亡。因此,我们使用蛋白酶体抑制剂处理肝脏恶性肿瘤细胞。发现,其同样能引起自噬和凋亡。然而,我们预先激活自噬后,再使用蛋白酶抑制剂处理,细胞的凋亡程度出现明显分化。随后我们发现p53的状态可能是引起这种分化的原因之一。研究方法1.蛋白酶体抑制剂MG132处理肝脏肿瘤细胞,Western blot检测p62的表达,LC3-I向LC3-II的转化以及荧光显微镜观察GFP-LC3颗粒的形成,反应MG132对肝脏肿瘤细胞自噬的调节。2.MG132处理细胞后,Western blot检测PARR以及PARP cleavage的表达,反应MG132对肝脏肿瘤细胞凋亡的调节。3. EBSS处理细胞预激活自噬,再使用MG132刺激细胞,检测ⅠPARP、PARP cleavage的表达以及荧光显微镜观察PI染色情况,判断预激活自噬对MG132所诱导凋亡的影响。4. Western blot检测MG132作用下细胞内与自噬、凋亡相关分子的变化情况。5.对预激活自噬反应差异的细胞中p53的鉴定,CHX抑制翻译检测p53半衰期,直接测序法鉴定p53是否突变,使用DNA损伤性药物Dox检测不同状态p53的反应,使用DNA结合区外位点的磷酸化p53抗体检测突变对于突变区外磷酸化位点的影响。6. Western blot检测预激活自噬对于突变型p53蛋白的影响。7.MG132所引起突变型p53降解的原因,Western blot检测自噬抑制剂对于突变型p53蛋白的影响,溶酶体探针检测MG132对溶酶体的调节,RT-PCR检测MG132作用下p53的转录是否受到影响。研究结果1.MG132作用下,肝母细胞瘤细胞HepG2、Huh6以及肝细胞癌细胞SMMC7721、Huh7的自噬均被激活。2.MG132促进了肝脏肿瘤细胞发生凋亡。3. EBSS处理预激活自噬,再使用MG132刺激,HepG2细胞和SMMC7721细胞的凋亡增多,而Huh6细胞和Huh7细胞的凋亡减少。4.检测相关分子变化后我们发现在上述两组细胞中,MG132作用下p53蛋白变化情况正好相反。5. HepG2细胞和SMMC7721细胞中为野生型p53,而Huh6细胞和Huh7细胞中的p53在DNA结合区发生了点突变(Huh6-A159D,Huh7-Y220C)。6.预激活自噬明显逆转了MG132所诱导的突变型p53的降解。7.MG132作用下突变型p53蛋白降解可能依赖于溶酶体功能的超激活,以及MG132对于p53的转录抑制。结论本研究使用蛋白酶体抑制剂MG132处理肝脏肿瘤细胞,发现其能激活自噬并诱导细胞凋亡。预激活自噬后,再使用MG132刺激细胞,细胞的凋亡出现明显分化,其中HepG2细胞和SMMC7721细胞的凋亡增多,而Huh6细胞和Huh7细胞的凋亡减少。随后的研究发现,两种细胞中p53蛋白在MG132作用下变化趋势完全相反。通过直接测序,我们识别了Huh6细胞和Huh7细胞中p53在DNA结合区的点突变。而预激活自噬能明显抑制MG132所引起的突变型p53蛋白的降解,进一步研究我们发现,MG132可能通过激活溶酶体功能以及转录抑制两种方式,促进突变型p53的蛋白降解。