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Hippo信号通路首先在果蝇遗传学筛选中被鉴定,主要由两个级联的激酶和下游的转录复合体组成,在哺乳动物中其核心成员包括MST1/2(mammalian STE20-like protein kinase1/2)/SAV1(Salvador)和下游的LATS1/2(Large tumor suppressor kinase1/2)/MOB1(MOB kinase activator 1A/B)两个激酶复合体以及YAP(Yes-associated protein)-TEADs(TEA domain)转录复合体。Hippo信号通路处于激活状态时,MST1/2磷酸化下游的LATS1/2和MOB1,磷酸化的LATS进而使YAP/TAZ(transcriptional co-activator with PDZ-binding motif)发生磷酸化,磷酸化的YAP/TAZ一方面与14-3-3蛋白结合滞留在胞质中,另一方面通过泛素蛋白酶体途径被降解,从而抑制下游靶基因转录。当Hippo信号通路处于失活状态时,激酶MST1/2和LATS1/2的活性处于抑制状态,不能使YAP发生磷酸化,非磷酸化的YAP大量入核,与转录因子TEADs结合激活下游靶基因转录。Hippo信号通路主要参与调控器官大小、组织再生以及肿瘤的发生发展。Hippo信号通路受到胞外多种信号的调节,而其效应分子YAP/TAZ在信号调节中发挥关键性作用。Hippo信号通路的调节异常会导致多种肿瘤的发生,而且YAP在多种肿瘤中显示高表达,然而Hippo信号通路对肿瘤发生发展的调节机制仍未研究清楚。生物信息学分析发现,去泛素化酶和四次跨膜蛋白家族中很多成员在肿瘤中显示高表达,那么去泛素化酶和四次跨膜蛋白基因是否可能通过影响Hippo信号通路来调控肿瘤的发生与发展。因此,系统地阐明这两个家族成员和Hippo信号通路的关系有助于理解其在肿瘤发生与发展中的作用,也为进一步理解Hippo通路提供新的线索。本论文首先采用双荧光素酶报告系统筛选去泛素化酶和四次跨膜蛋白家族中调控Hippo信号通路的成员。这个系统包括两个质粒:萤火虫荧光素酶报告质粒TBS(TEAD-binding-site)-luciferase检测Hippo信号通路的活性,海肾荧光素酶质粒pRL-TK为内参。为了验证该报告系统的可行性,我们进行了一系列阳性对照实验:首先我们针对Hippo信号通路的核心成员分别构建了过表达质粒(EGFP-N1-YAP、EGFP-N1-LATS2、EGFP-N1-MST2)和shRNA敲低质粒(shYAP、shLATS2)。然后在96孔板中进行实验,将TBS-luciferase报告质粒、pRL-TK以及目的质粒共转到HEK-293T细胞中,72h后用Dual-Luciferase?Reporter Assay检测试剂盒检测细胞中荧光素酶的活性,并计算其比值(萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶)。实验结果表明,过表达YAP和shRNA敲低LATS2能明显激活TBS-luciferase的活性,而过表达LATS2、MST2和shRNA敲低YAP能明显降低TBS-luciferase的活性。说明该报告系统能比较灵敏地反应细胞内Hippo信号通路的活性,可用于Hippo信号通路的筛选。接下来我们构建了去泛素化酶基因家族的shRNA质粒和过表达质粒Flag-DUBs。用双荧光素酶报告系统TBS-luciferase对去泛素化酶基因进行筛选。实验结果表明,去泛素化酶基因家族中的15个基因(USP2、USP18、USP20、USP22、USP29、USP36、USP42、USP43、USP49、USP52、USP54、PARP11、OTUD5、OTUB1、OTUD7B)对Hippo信号通路的活性有不同程度的上调。同样我们用双荧光素酶报告系统筛选了四次跨膜蛋白家族基因,发现四次跨膜蛋白家族中的13个基因(TSPAN2、TSPAN8、TSPAN9、TSPAN10、TSPAN13、TSPAN14、TSPAN15、TSPAN17、TSPAN21、TSPAN23、CD82、CD63、TSPAN33)对Hippo信号通路的活性有一定的上调。随后,我们用RT-qPCR进一步检测Hippo信号通路下游靶基因(CTGF、CYR61、ANKRD1)的mRNA水平,验证双荧光素酶报告系统筛到的候选基因对Hippo信号通路的影响。实验结果表明,去泛素化酶基因家族中USP2、USP29、USP52、PARP11和OTUD7B基因能上调Hippo信号通路下游靶基因(CTGF、CYR61、ANKRD1)的mRNA水平。四次跨膜蛋白家族中TSPAN8、TSPAN9、TSPAN13、TSPAN14、CD82、TSPAN23基因对Hippo信号通路的靶基因有一定的上调。进一步,我们通过Western blot检测Hippo信号通路核心成员(YAP、p-YAP、LATS1、MST1、p-MST)的蛋白水平,明确候选基因对Hippo信号通路的调节作用。实验结果表明,shRNA敲低USP2后,明显增加了细胞内p-YAP和LATS1的蛋白水平。Hippo信号通路在调控细胞的增殖分化中扮演着重要角色,而前期实验结果表明去泛素化酶基因USP2对Hippo信号通路有调节作用。因此,为明确USP2基因是否影响细胞增殖,接下来我们首先构建了稳定敲低USP2的细胞系,然后用MTS检测细胞的活力,结果显示,shRNA敲低USP2基因后抑制细胞活性。综上所述,结合Hippo信号通路双荧光素酶报告系统筛选结果和RT-qPCR检测Hippo信号通路下游靶基因mRNA水平变化结果,实验结果得出去泛素化酶基因家族中USP2、USP29、PARP11、OTUD7B基因能激活细胞内YAP的活性。进一步Western blot实验结果显示,USP2可能通过调节p-YAP和LATS1的蛋白水平进而影响Hippo信号通路。细胞增殖实验结果显示,USP2敲低抑制细胞活性。在四次跨膜蛋白基因家族筛选中,发现shRNA敲低TSPAN8、TSPAN9、TSPAN13、TSPAN14、CD82、TSPAN23后,明显抑制了TBS-luciferase的活性,说明这些膜蛋白基因对Hippo信号通路有一定的调节作用。为了寻找到调控Hippo信号通路的新基因,本论文对去泛素化酶基因和四次跨膜蛋白家族成员进行系统地筛选,为发现调节Hippo信号通路的新机制奠定理论基础,为Hippo信号通路开展在体的功能测试和分子机制研究提供依据,也为临床肿瘤治疗提供新的靶标。