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肿瘤严重的威胁着人类健康,其中以胃癌、食道癌、大肠癌为代表的消化道癌症威胁最为显著。由于肿瘤的发生发展机制的复杂性,寻找高效的治疗方法也面临着巨大挑战。免疫疗法的提出为肿瘤的治疗指明了新的方向。该疗法可通过增强肿瘤抗原的免疫原性以刺激自身特异性免疫应答,进而攻击肿瘤细胞。因此寻找肿瘤特异性抗原成为免疫疗法的关键。黑色素瘤相关抗原(Melanoma antigen,MAGE)正是这样一群肿瘤特异性抗原。本课题组一直致力于MAGE-A家族在肿瘤中表达意义的研究。本研究利用免疫组织化学法分别检测MAGE-As(包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12)、MAGE-A9和MAGE-A11在食管鳞癌组织、贲门腺癌组织、相应癌旁正常食管和胃组织中的表达及与其临床生物学指标之间的关系,特别是预后意义。并通过实时荧光定量RT-PCR(Real-time quantitative PCR,q RT-PCR)验证前期通过基因芯片筛选出的与MAGE-A11相关的多种基因,以期为MAGE-A家族成为食管癌和贲门癌的肿瘤特异性指标提供理论依据,并试图阐述其作用机制。主要研究内容和结果如下:第一部分MAGE-A家族在食管鳞癌和贲门腺癌组织中的表达情况及临床意义目的:探讨黑色素瘤相关抗原MAGE-As(包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12)、-A9和-A11在食管鳞癌组织、贲门腺癌组织,相应癌旁正常组织中的表达及与其临床生物学指标之间的关系,特别是预后意义。方法:1应用免疫组织化学法在睾丸组织中验证MAGE-As(包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12)、-A9和-A11的特异性。2应用免疫组织化学法检测60例食管鳞癌、30例贲门腺癌组织及相应癌旁正常粘膜组织中MAGE-As(包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12)、-A9和-A11蛋白的表达,分析其与患者临床生物学指标及其预后的关系。结果:1 MAGE-As(包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12)蛋白正常睾丸组织,食管鳞癌和贲门腺癌中均有表达。在正常睾丸组织中尤其精原细胞和精母细胞核中均显著表达。MAGE-As(包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12)蛋白在癌组织中主要定位于细胞质,部分定位于细胞核。60例食管鳞癌和30贲门腺癌旁正常组织中未发现MAGE-As(包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12)蛋白表达,食管鳞癌组织中MAGE-As(包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12)的阳性率为68.33%(41/60);贲门腺癌组织中MAGE-As(包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12)的阳性率为56.67%(17/30)。在食管鳞癌组织中,MAGE-As(包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12)蛋白表达与食管鳞癌患者的年龄、临床分期、组织学分级、肿瘤大小、淋巴转移均无相关性(P>0.05)。在贲门腺癌组织中,MAGE-As(包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12)蛋白与组织学分级(P<0.05)呈正相关,MAGE-As(包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12)蛋白表达与贲门腺癌患者的年龄、临床分期、肿瘤大小、淋巴转移均无相关性(P>0.05)。2 MAGE-A9蛋白正常睾丸组织,食管鳞癌和贲门腺癌中均有表达。在正常睾丸组织中尤其精原细胞和精母细胞核中均显著表达。MAGE-A9蛋白在癌组织中主要定位于细胞质,部分定位于细胞核。60例食管鳞癌和30例贲门腺癌旁正常组织中未发现MAGE-A9蛋白表达,食管鳞癌组织中MAGE-A9的阳性率为45%(27/60);贲门腺癌组织中MAGE-A9的阳性率为43.33%(13/30)。在食管鳞癌组织中,MAGE-A9蛋白表达与组织学分级(P<0.05)呈正相关,MAGE-A9蛋白与食管鳞癌患者的年龄、临床分期、肿瘤大小、淋巴转移均无相关性(P>0.05)。在贲门腺癌组织中,MAGE-A9蛋白与组织学分级(P<0.05)呈正相关,MAGE-A9蛋白表达与贲门腺癌患者的年龄、临床分期、肿瘤大小、淋巴转移均无相关性(P>0.05)。3 MAGE-A11蛋白正常睾丸组织,食管鳞癌和贲门腺癌中均有表达。在正常睾丸组织中尤其精原细胞和精母细胞核中均显著表达。MAGE-A11蛋白在癌组织中主要定位于细胞质,部分定位于细胞核。60例食管鳞癌和30例贲门腺癌旁正常组织中未发现MAGE-A11蛋白表达,食管鳞癌组织中MAGE-A11的阳性率为66.67%(40/60);贲门腺癌组织中MAGE-A11的阳性率为53.33%(16/30)。在食管鳞癌组织中,MAGE-A11蛋白表达与临床分期和肿瘤大小(P<0.05)呈正相关,MAGE-A11蛋白与食管鳞癌患者的年龄、组织学分级、淋巴转移均无相关性(P>0.05)。在贲门腺癌组织中,MAGE-A11蛋白与临床分期和组织学分级(P<0.05)呈正相关,MAGE-A11蛋白表达与贲门腺癌患者的年龄、肿瘤大小、淋巴转移均无相关性(P>0.05)。4 60例食管鳞癌组织标本中,MAGE-As(包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12)、-A9和-A11蛋白表达呈均匀分布,三种蛋白同时表达的有19例,占31.67%(19/60)。60例食管鳞癌中三种蛋白阳性表达率之间有明显差异(χ2=8.472,P=0.014)且MAGE-As(包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12)的表达率高。5 30例贲门腺癌组织标本中,MAGE-As(包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12)、-A9和-A11蛋白表达呈均匀分布,三种蛋白同时表达的有11例,占36.67%(11/30)。30例贲门腺癌中三种蛋白阳性表达率之间没有明显差异(χ2=1.156,P=0.561)。6 MAGE-As(包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12),-A9和-A11蛋白表达阳性的食管鳞癌患者和贲门腺癌患者的生存期均显著低于其表达阴性的患者。结论:MAGE-As(包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12)、-A9和-A11蛋白是食管癌和贲门癌特异性抗原。MAGE-As(包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12)、-A9和-A11蛋白可作为食管鳞癌和贲门腺癌预后不良的指标。第二部分对基因芯片中筛选出的MAGE-A11相关基因的初步验证目的:以期验证基因芯片筛选出的与MAGE-A11相关的多种基因,CEP295(centrosomal protein 295k Da,CEP295)、TRIM33(tripartite motif containing 33,TRIM33)、KIF23(kinesin family member 23,KIF23),FN1(fibronectin 1,FN1)、CKAP5(cytoskeleton associated protein 5,CKAP5)、PNN(pinin,desmosome associated protein,PNN),MMP13(matrix metallopeptidase13,MMP13)、MMP26(matrix metallopeptidase 26,MMP26)和MMP28(matrix metallopeptidase 28,MMP28)在转染MAGE-A11质粒组与转染空载体组之间m RNA的表达水平的差异,探讨MAGE-A11在食管癌的发生、发展中可能的作用机制,为阐明MAGE-A11在食管癌中的作用提供初步理论依据。方法:实时免疫荧光定量PCR验证:引物的设计:登录GENEBANK网站,设计上、下游引物。嵌合荧光法(SYBR®Green I)PCR:采用ABI SYBR®Green荧光定量PCR方法(具体反应体系见ABI SYBR®Green荧光定量PCR方法说明)。结果:1在转染MAGE-A11质粒的Eca109食管癌细胞系中,CEP295、TRIM33、KIF23、FN1、MMP13、MMP26和MMP28m RNA的表达水平显著高于空转染组及未转染组。MAGE-A11质粒转染上调了CEP295、TRIM33、KIF23、FN1、MMP13、MMP26和MMP28基因的转录水平,CKAP5和PNNm RNA的表达水平显著低于空转染组。MAGE-A9质粒转染下调了CKAP5和PNN基因的转录水平,差异有统计学意义(P<0.05)。2在转染MAGE-A11质粒的TE-1食管癌细胞系中,CEP295、TRIM33、KIF23、FN1、MMP13、MMP26和MMP28m RNA的表达水平显著高于空转染组及未转染组。MAGE-A11质粒转染上调了CEP295、TRIM33、KIF23、FN1、MMP13、MMP26和MMP28基因的转录水平,CKAP5和PNN m RNA的表达水平显著低于空转染组。MAGE-A11质粒转染下调了CKAP5和PNN基因的转录水平,差异有统计学意义(P<0.05)。3在转染MAGE-A11质粒的TE-13食管癌细胞系中,CEP295、TRIM33、KIF23、FN1、MMP13、MMP26和MMP28m RNA的表达水平显著高于空转染组及未转染组。MAGE-A11质粒转染上调了CEP295、TRIM33、KIF23、FN1、MMP13、MMP26和MMP28基因的转录水平,CKAP5和PNNm RNA的表达水平显著低于空转染组。MAGE-A11质粒转染下调了CKAP5和PNN基因的转录水平,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:MAGE-A11通过调控泛素化相关基因(上调TRIM33),增殖凋亡的相关基因(上调CEP295和KIF23),肿瘤侵袭和转移方面的相关基因(上调MMP13、MMP26、MMP28和FN1,下调CKAP5和PNN)在食管癌的发生、发展中起着重要作用。