过去二十多年的研究清楚地表明靶向纳米递送系统在药物治疗方面有明显的优势。已有的研究在克服一些生理屏障、实现不同药物靶向递送方面取得了一些成果，但也面临诸多挑战。一方面，目前仅有个别聚合物纳米释药系统获批临床使用，而聚合物纳米释药系统制备的复杂性和不可控性是限制目前实验室成果向临床转化的主要因素之一。另一方面，在通过刺激响应性纳米递送系统靶向病灶微环境来达到准确定位时，具有良好生物相容性的纳米系统的构建依然存在一定问题亟待解决。本课题拟通过两个部分的研究来解决上述问题。课题1采用简易的方法合成了结构简单的多肽，通过其自组装形成结构、粒径及其分布可控的纳米微粒，并以此纳米微粒作为药物载体，用于口服靶向递送抗炎药物吲哚美辛(IND)治疗关节炎研究。课题2中我们通过动力学控制的缩醛化反应制备了一系列pH响应性α-环糊精材料，以其构建pH响应性纳米微粒，作为靶向肿瘤微环境的载体；并通过一系列体内外实验来研究该类纳米载体作为紫杉醇(PTX)递送系统在肿瘤靶向治疗中的应用。方法1.载体材料合成通过1,1,1,3,3,3-六甲基二硅氮烷引发β-苄基L-天冬氨酸、γ-苄基谷氨酸和ε-(苄氧羰基)-L-赖氨酸的N-羧基酸酐单体聚合来合成多肽1、8和9。肽1在正丁胺、正己胺、正辛胺存在下的氨解来合成肽2、3和4。制备多肽5、6和7时，首先将D,L-天冬氨酸在85％H3PO4中聚合成聚(D,L-琥珀酰亚胺)，再加入正丁胺、正己胺和正辛胺即可得到多肽5、6和7。合成缩醛化α-环糊精(Ac-aCD)时，将α-CD在对甲基苯磺酸吡啶盐、2-甲氧基丙烯存在下进行一步缩醛化反应，反应不同时间点取反应液并沉淀得不同产物。葡聚糖在对甲氧基吡啶盐、2-甲氧基丙烯存在下，一步完成缩醛化反应，3h后沉淀产物缩醛化葡聚糖(Ac-Dex)。1,4-环己烷二甲醇在p-甲苯磺酸和2,2-二甲氧基丙烷作用下，生成聚(1,4-环己烷二甲醇)(PCADK)。2.材料结构表征材料结构用红外光谱(FT-IR)和核磁共振光谱(NMR)来确定。飞行质谱(MALDI-ToF)表征各多肽分子结构和测定多肽分子量。Ac-Dex和PCADK分子量用凝胶渗透色谱法(GPC)测定。3.纳米粒制备多肽组装体及其载药纳米微粒通过透析法制备。将多肽或多肽和药物溶于一定极性有机溶剂中，在水中透析除去有机溶剂即可得到不同多肽纳米粒。Ac-aCD纳米微粒通过乳液乳剂挥发法制备。首先，用二氯甲烷溶解Ac-aCD或Ac-aCD/PTX)，加入含1%聚乙烯醇(PVA)的磷酸盐缓冲液(PBS)中，用超声探头超声20s，将所得乳液倾入0.3%PVA/PBS中，搅拌挥发3h后收集纳米粒。采用同样的方法来制备PTX/PLGA、PTX/Ac-Dex和PTX/PCADK纳米微粒。4.载药量测定精密称取IND/多肽1载药组装体，用3ml乙醇萃取药物3次，合并萃取液并定容至10ml，用紫外分光光度仪在310nm处测定IND吸光度。精密称取PTX/Ac-aCD纳米粒，用DMSO溶解，高效液相色谱法测定PTX浓度。5.纳米粒形态表征及粒径测定用扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)进行形态表征，并用粒度仪测量粒径大小。6. Ac-aCD纳米粒pH敏感性评价将Ac-aCD纳米粒分别置于pH7.4和pH5.0的PBS中，不同时间点观察纳米粒水解并拍照，同时测定纳米粒胶体溶液的光散射强度变化。7.多肽纳米粒稳定性测试将空白多肽纳米粒置于含有胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的pH7.4PBS中，不同时间观察纳米粒水解并用SEM和TEM观察形态。8.体外释放将IND/多肽1纳米粒装入透析袋中，放入pH7.4PBS中进行释放，用IND作为对照。为了模拟IND/多肽1纳米粒在胃肠道中的释放，先将IND/多肽1纳米粒和IND原料药置于pH1.2的PBS中释放一段时间，再置于pH7.4PBS中释放。PTX/Ac-aCD纳米粒的释放在pH7.4PBS和pH5.0PBS的介质中进行。9.纳米粒细胞毒性评价将不同空白纳米粒加入培养基中对肿瘤细胞和正常细胞进行培养，用噻唑蓝(MTT)法测定细胞活性，并用流式细胞仪评价Ac-aCD纳米粒对细胞凋亡的影响。10. PTX纳米粒体外抗肿瘤评价将PTX/Ac-aCD、PTX/PLGA、PTX/Ac-Dex、PTX/PCADK和PTX加入培养基中对肿瘤细胞进行培养，用MTT法测定细胞活性，用流式细胞仪测定PTX/Ac-aCD、PTX/PLGA和PTX对细胞凋亡的影响。将PTX/Ac-aCD和PTX加入细胞培养基中对细胞进行培养，不同时间点观察药物对肿瘤细胞微管的影响。11.体内药动学研究将IND/多肽1纳米粒和原料药给雄性SD大鼠灌胃给药，剂量为4mg/kg，不同时间点取血测定血药浓度。12. IND/多肽1纳米粒药效学研究给雄性SD大鼠灌胃给予IND/多肽1纳米粒、吲哚美辛原料药、空白多肽1纳米粒和生理盐水，并测定大鼠右后足趾体积。半小时后，给大鼠右后足趾注射角叉菜胶，不同时间测定其足趾体积。13.空白Ac-aCD纳米粒体内急性毒性试验昆明小鼠静脉注射不同剂量的空白Ac-aCD纳米粒，观察小鼠身体及精神状况。15天后，处死小鼠，测试血常规，称量脏器重量、并计算脏器指数，主要脏器通过病理切片进行观察。14. PTX/Ac-aCD纳米粒药效学研究将黑色素瘤肿瘤组织块接种到裸鼠皮下，七天后，尾静脉注射给药，高剂量为10mg/kg、中剂量为3.3mg/kg、低剂量为1mg/kg，观察肿瘤生长情况，测定肿瘤体积。用生理盐水和原料药作为对照，原料药剂量为10mg/kg。另一组实验中，比较Ac-Dex、PCADK、PLGA载药纳米粒的抗肿瘤活性，同样尾静脉注射给药，剂量为10mg/kg。15.靶向性研究雄性SD大鼠皮下注射角叉菜胶，待大鼠足趾发生明显肿胀后，灌胃给予包裹量子点(CdSe)ZnS的多肽1纳米粒和生理盐水，12h后用活体成像观察大鼠足趾荧光。将Cy5载入Ac-aCD纳米粒中，加入培养基中对细胞进行培养，不同时间点看纳米粒在细胞中的分布和转运情况。将(CdSe)ZnS量子点载入Ac-aCD纳米粒中，经尾静脉注射入荷瘤小鼠体内，12h后观察老鼠体内荧光分布。结果1.课题1结果1)经FT-IR、NMR和MALDI-ToF表征表明成功制备了不同结构、不同分子量的多肽。2)多肽成球性较好，纳米粒粒径在60-200nm之间；以DMSO作为溶剂时，纳米粒粒径分布较均匀。3)细胞增殖测试显示多肽1纳米粒对细胞毒性不明显。多肽纳米粒在pH7.4PBS、含有胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的PBS中孵育后，没有发生明显的水解和酶解反应。4)IND载药纳米粒的载药量和包封率分别为19.8%和98.8%。DSC结果表明无明显吲哚美辛吸收峰，说明其中药物以分子形式分散。5)体外释放及模拟胃肠道释放结果表示IND/多肽1纳米粒和IND在pH1.2环境中无释放，pH7.4时快速释放，且IND/多肽1纳米粒的释放速率远远大于IND原料药。6)药动结果显示，IND/多肽1纳米粒比IND原料药在动物体内释放更快，达峰更迅速，且能较长时间维持较高的血药浓度，药时曲线下面积(AUC)约为IND原料药的1.7倍。7)药效结果表明，IND/多肽1纳米粒比IND原料药能更有效减轻炎症反应，有显著的治疗效果。8)靶向研究结果表明，多肽1纳米粒能到达病灶部位，且能在炎症部位富集。2.课题2结果1)通过FT-IR、1H-NMR分析表示成功合成了Ac-aCD，且反应迅速，反应数分钟已有缩醛基团形成。2)通过对Ac-aCD纳米粒的粒径测定表明乳液法制备得到的纳米粒粒径在250nm左右，电子扫描显微镜和透射电子显微镜的观察显示材料成球性良好。3)PTX/Ac-aCD载药量在10%左右，与PLGA、Ac-Dex、PCADK相比，对PTX具有更高的载药量。4)Ac-aCD纳米粒在pH5.0PBS中水解速率大于pH7.4，光散射强度也下降迅速。5)体外释放结果表明PTX/Ac-aCD在pH5.0PBS中释放速率和释放量均明显高于pH7.4。6)细胞增殖测试显示Ac-aCD空白纳米粒毒性较小。但载入PTX后，与PTX、PTX/PLGA、PTX/Ac-Dex和PTX/PCADK相比PTX/Ac-aCD在细胞中毒性有所增强，对耐药细胞尤其明显，能实现多药耐药性逆转。细胞凋亡实验表明，PTX/Ac-aCD纳米粒能促使肿瘤细胞凋亡。7)体内毒性实验说明Ac-aCD空白纳米粒急性毒性较小，在剂量达到250mg/kg时，对动物无明显毒性，其半数致死量在500mg/kg以上。8)体内药效表明PTX/Ac-aCD纳米粒与原料药及PTX/PLGA纳米粒、PTX/Ac-Dex纳米粒和PTX/PCADK纳米粒相比，具有更显著的疗效，且毒副作用更低。9)细胞内靶向研究表示Ac-aCD纳米粒能被细胞吞噬，通过内涵体/溶酶体途径转运。体内靶向表明，纳米粒能在肿瘤部位富集，达到靶向目的。结论1.课题1结论1)通过简便的方法用β-苄基L-天门冬氨酸、 γ-苄基谷氨酸、ε-(苄氧羰基)-L-赖氨酸和D,L-天冬氨酸合成了结构简单的不同多肽。2)用简单的透析法制备得到纳米粒，其成球性良好，粒径分布均匀，且稳定性较高，不发生水解和酶解反应，同时纳米粒对细胞毒性较小，具有良好的生物相容性。3)IND/多肽1自组装纳米粒具有较高的载药量，并能快速释放药物，大大加快药物的溶出速率，提高药物生物利用度。自组装纳米粒在体内保留时间明显大于原料药，可显著性提高药效，能明显降低药物对胃肠道的刺激性，并能在靶向部位富集，故有望作为一些药物靶向给药的载体材料。2.课题2结论1)通过简单的缩醛化反应合成了具有pH敏感性的材料Ac-aCD，并成功制备了粒径可控且粒径分布较均匀的纳米粒，对细胞和小鼠均无明显毒性，具有良好的生物相容性。各反应时间点的纳米粒均具有pH敏感性，在弱酸性环境中水解速率明显大于中性环境。载药后在pH5.0PBS中释放速率和释放量都远远大于pH7.4。2)由于肿瘤组织和细胞内涵体/溶酶体具有相对较低的pH，具有pH敏感性的Ac-aCD纳米粒能靶向至肿瘤组织和肿瘤细胞内的内涵体/溶酶体中。3)将PTX载入到Ac-aCD纳米粒，相对于PLGA等材料不仅载药量有所提高，对抑制肿瘤细胞生长和加速凋亡具有显著优势，对耐药肿瘤细胞也能有效逆转。与PTX、PTX/PLGA和具有pH敏感性的同类PTX/Ac-Dex、 PTX/PCADK纳米粒相比，PTX/Ac-aCD纳米粒具有更有显著的治疗效果。故Ac-aCD纳米粒有望作为靶向肿瘤微环境的载体材料。