鸭圆环病毒(Duck circovirus, DuCV)是目前发现的最小的鸭病毒,DuCV感染后可造成鸭生长迟缓,体重下降等症状。迄今为止,对DuCV的致病机制仍不完全清楚,圆环病毒感染通常与淋巴组织损伤有关,并且可以引起宿主淋巴细胞凋亡。因此,研究鸭圆环病毒在人工感染雏鸭体内的侵染分布、组织病理学观察及其致凋亡作用对DuCV致病机制探讨具有十分重要的科学意义。1.实时荧光定量PCR检测鸭圆环病毒方法的建立及半数感染量的确定为定量检测DuCV在感染鸭体内侵染分布的研究,根据NCBI最新公布的所有DuCV序列,比对找出保守区并设计引物,构建包含rep目的基因片段的标准质粒,成功建立特异、敏感的检测DuCV-rep基因的qPCR方法。该建立的qPCR法检测鸭疫里默氏杆菌、致病性大肠杆菌等的基因组模板均无交叉反应,对DuCV特异性反应良好,并且最高检测灵敏度达9.23×101copies/μL,每个梯度之间Cq值标准偏差(SD)在0.16-0.30之间,变异系数(CV)在0.79-1.64之间,重复性良好。此外,通过制备DuCV阳性病料悬液,并对病悬液进行病毒的绝对定量,然后用不同病毒拷贝数稀释度的病悬液人工感染3周龄雏鸭,根据Reed-Muench法算出半数感染量为6.57×102.68 copies/mL。2.荧光定量分析鸭圆环病毒在人工感染雏鸭体内的侵染分布及组织病理学观察的研究为定量分析DuCV在人工感染雏鸭体内的侵染分布以及观察DuCV对组织的病理损伤,本研究通过DuCV人工感染3周龄雏鸭后,对胸腺、脾脏、法氏囊、肝脏、肾脏进行组织病理学观察,并通过已建立的检测DuCV的qPCR方法,定量检测病毒在心脏、肝脏、脾脏、肾脏、法氏囊等17个组织器官的动态变化。组织病理学检测结果显示,人工感染DuCV后,胸腺、脾脏、法氏囊、肝脏、肾脏均出现不同程度的病理损伤,主要表现为毛细血管充血、出血,炎性细胞浸润;淋巴细胞稀疏,细胞间隙增宽；巨噬细胞浸润；淋巴细胞发生核浓缩、核碎裂；出现空泡变性等。qPCR结果显示,攻毒后8d在免疫器官感、消化器官、消化道、呼吸道(除肺脏以外)及其他组织器官中均可检测至DuCV;其中免疫器官病毒拷贝数在103.5 copies-104.5 copies,消化器官病毒拷贝数在103.9 copies-104.6 copies,消化道病毒拷贝数在102.8 copies-104.7 copies,呼吸道病毒拷贝数在102.8 copies-104.1 copies,其他组织器官(心脏、肾脏、大脑)病毒拷贝数在102.6 copies-104.9 copies。3.人工感染鸭圆环病毒致雏鸭免疫器官细胞凋亡的动态研究本研究利用免疫组化技术和DNA末端转移酶标记技术(Terminal-deoxynucleotidy Transferase-mediated Nick-end Labeling, TUNEL)对感染鸭的法氏囊、哈德氏腺、胸腺、脾脏、肝脏、肾脏分别进行了病毒的抗原定位、定量以及细胞凋亡的检测。免疫组化结果显示,在攻毒后8d-48d免疫组化检测法氏囊、哈德氏腺、胸腺、脾脏、肝脏和肾脏中病毒含量,平均光密度值在0.0259±0.0148至0.1681±0.0271,随后病毒含量显著降低(P<0.01),平均光密度值在0.001±0.0002至0.0614±0.0035,说明在攻毒后8d-48d期间,病毒的复制比较活跃。细胞凋亡检测结果显示,在整个感染过程中攻毒组细胞凋亡反应显著(P<0.01)高于对照组。结合细胞凋亡与免疫组化结果,并不能明显看出病毒含量与细胞凋亡的关系,因此不能完全说明DuCV感染与细胞凋亡作用的关系。但通过细胞凋亡检测结果可以说明,DuCV感染的确显著引起靶细胞凋亡,在免疫组织中可能造成免疫器官损伤导致免疫抑制。本研究对DuCV感染与细胞凋亡关系的研究,为我们深入了解DuCV致病机制及防治提供新的思维。