【摘 要】
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超分辨定位成像（Super-Resolution Localization Microscopy,SRLM）可以提供数十纳米的空间分辨率,在细胞精细结构研究中有着广泛的应用。SRLM的照明强度通常在1~10 k W/cm2,会导致较高的背景荧光。全内反射（Total Internal Reflection,TIR）照明凭借其薄层照明的优势,可以用于抑制SRLM中的背景荧光,非常适合于研究细胞膜附近
【基金项目】
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国家自然科学基金（No.81427801）；
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超分辨定位成像（Super-Resolution Localization Microscopy,SRLM）可以提供数十纳米的空间分辨率,在细胞精细结构研究中有着广泛的应用。SRLM的照明强度通常在1~10 k W/cm2,会导致较高的背景荧光。全内反射（Total Internal Reflection,TIR）照明凭借其薄层照明的优势,可以用于抑制SRLM中的背景荧光,非常适合于研究细胞膜附近的蛋白或细胞器。但是,由于SRLM需要使用多个波长来实现荧光分子的激活和激发,倘若采用常规的自由空间光路来构建TIR照明方案,将导致较高的光学对准难度和较差的机械稳定性。此外,为了在整个成像视场范围内获得均匀的空间分辨率,研究人员还必须确保在整个视场范围内形成均匀照明。本文旨在发展一种可以抑制背景荧光的光纤化TIR均匀照明方案,并将其用于构造具有均匀分辨率的SRLM系统。研究内容简述如下:（1）优化了基于多模光纤的TIR均匀照明方法。本文对可实现TIR照明的光纤芯径进行了分析和选型,确认多模光纤出射端的芯径为50μm。为了消除多模光纤传输照明产生的激光散斑,本文设计了一种基于随机路径点扫描的模式混合方法,实现了基于多模光纤的TIR均匀照明方案。该方案可以提供直径为80μm的照明视场,散斑对比度为0.11,优于柯勒照明方案（均匀照明典型方案,散斑对比度为0.13）。（2）发展了基于多模光纤合束器的多波长TIR均匀照明方案并搭建了成像系统。针对SRLM的多波长照明需求,并结合前文实现均匀照明的方法,本文通过仿真设计并定制了“2进1出”的多模光纤合束器。该光纤合束器可为激发光提供约33%的全系统传输效率,优于商用同类型光纤合束器（传输效率为15%）。在此基础上,搭建了基于光纤化TIR均匀照明的SRLM系统,其样品端的激发光功率可达990m W,满足视场直径为80μm的SRLM功率需求。（3）验证了SRLM系统的生物成像性能。本文对贴壁细胞中微管结构进行成像,证明了分辨率的均匀性。利用悬浮细胞样品对比了落射式照明和TIR照明对单分子荧光图像的影响,相较而言,TIR照明可将背景荧光降低36%,信噪比提升6%,信背比提升45%。在最终的超分辨图像中,分辨率提升了13%。综上,本文研究了基于多模光纤的TIR均匀照明方法,为研制具有抑制背景荧光、机械稳定性高、均匀照明等特点的SRLM系统提供了技术支持,有助于扩展SRLM的生物医学应用。
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