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捻转血矛线虫会引起严重的牛羊寄生虫病,寄生于宿主真胃,造成幼畜死亡,带来严重的经济损失。目前捻转血矛线虫病的防控仍然是以药物预防为主,但线虫耐药问题的日益严重,迫切需要探索新的防控措施和干预靶点。捻转血矛线虫经历自由生活阶段和寄生阶段,感染期幼虫为三期幼虫(L3),当L3幼虫经口感染宿主后,约3天到达皱胃,然后钻入皱胃黏膜下发育至四期幼虫(L4)后再钻出黏膜定植于皱胃表面发育至成虫。钻入胃黏膜下方是捻转血矛线虫入侵过程中的重要环节。透明质酸酶(HAase)能够降解胞外黏多糖透明质酸,钩虫相关的研究表明在入侵过程中发挥了作用,而且体外培养捻转血矛线虫时,在L3幼虫发育至L4幼虫的早期过程中,能够向体外释放透明质酸酶水解透明质酸。本实验室前期的研究工作表明,辐照后捻转血矛线虫的成虫发育率降低,且下调透明质酸酶基因的表达。因此我们推测,透明质酸酶的表达量与捻转血矛线虫的毒力存在联系。基于此我们开展了捻转血矛线虫透明质酸酶功能的初步研究工作。首先根据公布在GenBank上的捻转血矛线虫透明质酸酶的全基因序列,分析表明透明质酸酶基因编码511个氨基酸,理论分子量为57kD,利用signalP预测显示存在信号肽。PCR扩增目的基因序列,经双酶切、测序鉴定后转化至大肠杆菌中进行原核表达并通过Western blot分析其免疫原性;通过免疫组化的方法鉴定透明质酸酶在捻转血矛线虫L3幼虫中的分布情况;最后用RNA干扰技术,针对透明质酸酶基因设计并合成特异性siRNA,通过电转方式将siRNA导入捻转血矛线虫感染性L3幼虫体内,利用实时荧光定量PCR分析透明质酸酶基因在L3幼虫中的转录抑制效果;将透明质酸酶特异性siRNA电转导入L3幼虫24h后感染绵羊皱胃外植体,检测透明质酸酶基因沉默后虫体对皱胃组织的侵入率,并且对L3幼虫入侵后的皱胃外植体进行组织切片观察;同时将透明质酸酶特异性siRNA电转导入L3幼虫24h后感染绵羊,定期采集绵羊粪便检查虫卵数,第35d后剖检绵羊皱胃,检查荷虫数以及成虫形态及体表损伤。初步结果表明:western-bolt结果表明重组HC-HAase有良好的免疫原性,而且免疫组化结果显示HAase在虫体中主要分布于头部,为证明该酶在入侵时发挥重要作用提供有效依据;电转24h后实时荧光定量PCR检测捻转血矛线虫L3幼虫透明质酸酶基因的表达量,试验组中透明质酸酶基因的相对表达量显著低于对照组(p<0.05),通过电转法将透明质酸酶基因特异性siRNA导入脱鞘捻转血矛线虫L3幼虫后能有效降低透明质酸酶的酶活性单位。体外实验结果表明将透明质酸酶基因干扰后捻转血矛线虫L3幼虫对胃组织外植体的入侵率为9.45%,而对照组为53.62%。动物体内实验结果表明脱鞘捻转血矛线虫L3幼虫经过siRNA干扰后感染绵羊18-32天检测粪便中虫卵数量,干扰组绵羊的每克粪便虫卵数明显低于对照组;35天后剖检皱胃内成虫数,对照组虫体定植率为77.1%,实验组为39.7%,且两组存在显著差异(P<0.01);捻转血矛线虫L3幼虫可能通过分泌透明质酸酶分解宿主黏膜组织,有利于虫体侵入宿主黏膜,进而促进虫体在宿主黏膜中的定植。透明质酸酶作为捻转血矛线虫入侵时的关键毒力因子,其功能性研究,有利于对捻转血矛线虫病的防治。