[研究背景]肾上腺皮质癌(adrenocortical carcinoma, ACC)是原发于肾上腺皮质的恶性肿瘤,每年发病率约为0.5-2/100万人,发病率低,占所有恶性肿瘤的0.02%,临床较为罕见。该肿瘤的恶性程度高,侵袭力强,且早期确诊率较低,五年生存率仅为40%。大部分肾上腺皮质癌为单侧单发,但有2%-6%为双侧发病,可合并Li-Fraumeni综合征、Ⅰ型多发性内分泌腺瘤综合征、Beckwith-Wiedemann综合征以及主要见于儿童Garney综合征。肾上腺皮质癌病因仍不明确,有研究报道,染色体11p,13q和17p上发生的染色体杂合可能有一定作用,并且它为多基因相关肿瘤,涉及多条信号通路,发病机制较为复杂,目前研究发现包括Wnt、IGF-2、P53等多种信号途径参与肾上腺肿瘤发生、进展到腺癌的过程。在临床当中,如何鉴别肾上腺皮质癌和肾上腺皮质腺瘤,这对病理学家而言是一个很大的问题,为了更好地判断这些病变的预后和预测其转移能力,国际上较为认可的是Weiss提出了九条组织学标准,符合三条以上的病变即被考虑为恶性。肾上腺皮质癌的治疗方法较为局限,以手术切除原发肿瘤为主,缺乏有效的药物治疗。目前关于ACC的一些研究已经确定了过表达胰岛素样生长因子2(IGF-2)和被激活P-catenin作为关键因素参与肾上腺皮质癌的发展,但仍未能阐明其发生、发展的分子机制,所以寻找稳定、有效的基因诊断及治疗靶点,对阐明ACC发病的分子机制及提高ACC的早期诊断及治疗显得十分重要。PCAF (P300/CBP Associated Factor)为共激活辅因子核蛋白,作为一个重要的非组蛋白调节因子与许多肿瘤相关生理学过程存在紧密联系,如细胞周期进展、细胞分化、凋亡和转录调节。PCAF通常存在于具有乙酰转移酶活性的复合物中,这些复合物在转录调节上的功能主要有两种：一是作为辅激活因子,另一种是通过使组蛋白和非组蛋白特定位点的赖氨酸残基(Lys)发生乙酰化来激活转录。PCAF基因在肿瘤中的研究尚是一个新的领域,其在不同肿瘤中的表达却不一致,PCAF在多种肿瘤组织或肿瘤细胞系中呈表达降低或不表达,包括食管鳞状细胞癌、乳腺癌、肝癌等,其肿瘤细胞系包括：Ovmana、OVI-P等,研究发现造成PCAF表达下调的原因包括基因组的杂合性缺失、启动子的甲基化及突变等。而PCAF在小儿中枢神经系统肿瘤、肾母细胞瘤以及前列腺癌等肿瘤中高表达,可能与肿瘤的发生、发展有促进作用。最近的一些研究表明组蛋白乙酰基转移酶(CBP/P300)可以乙酰化β-catenin,并且调节其与Tcf4和E2F1的共存关系,这也给我们进一步研究PCAF与Wnt/β-catenin的关系提供了理论依据。Wnt/β-catenin信号通路是在一条进化过程中高度保守的信号转导途径,调节多种生物性状及生命活动,其主要介导成分为辅助转录因子β-catenin。当Wnt信号通路发生异常激活时,引起细胞胞质内β-catenin蛋白异常堆积并穿胞入核,与核内转录因子T淋巴细胞因子(TCF)/淋巴样增强因子(LEF)形成复合体,特异性激活下游众多靶基因如cyclinD1、c-myc、VEGF、MMP-7等,从而促进肿瘤的发生。Wnt/β-catenin信号通路异常活化已经在很多肿瘤如肝癌、胃癌、宫颈癌等得到了证实,而对于肾上腺皮质癌,也有研究发现,Wnt经典信号途径异常活化以及其下游基因产物的异常表达在肾上腺皮质肿瘤发生及转移中起着重要的作用。上皮-间质转化(epithelial mesenchymal transition, EMT)是诱发上皮来源的肿瘤细胞侵袭和转移的基础,多种信号通路参与此过程,包括Mark通路、Notch通路及Wnt信号通路等,其中Wnt/β-catenin信号途径的异常活化,诱导EMT的发生,使肿瘤细胞间粘附力降低,增强肿瘤细胞的侵袭和转移能力。研究发现多种实性肿瘤和恶性血液性疾病都与之有关,而关于肾上腺皮质癌是否存在EMT过程的发生,国内外文章中暂无相关报道。本研究基于此背景通过从临床标本与细胞分子水平深入探索PCAF基因与Wnt/β-catenin信号通路在肾上腺皮质癌中发生、发展的相关机制,有利于为ACC早期诊断、有效的治疗和预防奠定理论基础。[目的]通过收集肾上腺皮质癌、肾上腺皮质腺瘤及正常肾上腺组织患者临床病理组织切片,探索检测PCAF与EMT相关蛋白、Wnt通路关键蛋白β-catenin在肾上腺皮质肿瘤当中表达情况及相关性。利用小分子干扰RNA (siRNA)靶向抑制肾上腺皮质癌SW13细胞中PCAF基因表达,进而在体外细胞及分子水平探讨PCAF在肾上腺皮质癌细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响及作用机制。[方法]1).收集广州军区总医院泌尿外科2003年-2014年手术切除的肾上腺组织石蜡切片,其中包含肾上腺皮质癌15例、肾上腺皮质腺瘤20例、正常肾上腺组织13例,免疫组化法检测PCAF蛋白、EMT相关蛋白E-Cadherin、Vimentin蛋白、Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白β-catenin表达情况及其相关性。2).针对人PCAF基因设计合成3对候选siRNA序列,根据RNA干扰技术利用转染试剂Lipo 2000将其瞬时转入体外培养的肾上腺皮质癌SW13细胞中,荧光显微镜下观察转染效率,确定最优转染条件,qRCR检测3对候选siRNA序列对PCAF基因表达的抑制作用,并筛选出最有效的siRNA序列。3).利用筛选出最有效的PCFA-siRNA瞬时转染肾上腺皮质癌SW13细胞,并确定分组实验组(PCAF-siRNA),阴性对照组(NC-siRNA)以及空白组,免疫细胞化学染色方法检测各组细胞内β-catenin蛋白的位置分布,IPP软件对免疫化学染色光密度进行分析。qPCR检测各组间β-catenin的表达,Western blot方法验证转染后PCAF蛋白表达,并通过对各组SW13细胞总蛋白及核蛋白的分别提取,检测β-catenin在各转染组的表达差异。双荧光素酶报告基因实验检测各组间报告强度,验证经沉默PCAF表达后是否影响SW13细胞Wnt/β-catenin通路的活性。4).利用RNA干扰瞬时转染的各分组SW13细胞,即：实验组(PCAF-siRNA),阴性对照组(NC-siRNA)以及空白组,Western blot及qPCR检测各组SW13细胞Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因：c-myc、Cyclin D1、CD4、VEGF、MMP-7、 PPAR-γ等的表达差异。[结果]1).相对于肾上腺皮质腺瘤及正常肾上腺皮质组,PCAF在肾上腺皮质癌细胞内呈过表达状态,差异具有统计学意义(P=0.018,P=0.01),在15例肾上腺皮质癌标本中,有14例β-catenin蛋白存在核表达,ACC组相对于肾上腺皮质腺瘤组及正常肾上腺组β-catenin核表达明显增多(P<0.05)。而与腺瘤组及正常组相比,ACC组E-Cadherin蛋白表达明显降低,、/imentin蛋白表达增高,具有统计学差异(P<0.05)。肾上腺皮质癌组中PCAF表达和β-catenin核表达呈正相关(r=0.375,P<0.05),与E-caherin蛋白表达呈负相关(r=-0.432,P<0.05),与Vimentin蛋白表达呈正相关(r=0.420,P<0.05)。2).选用终浓度为50nM的Cy3-siRNA转染SW13细胞,24小时后荧光倒置显微镜下观察转染效率约为90%,转染效果符合后续实验标准,综合细胞状态及转染效率,最终确定siRNA浓度为50nM、Lipo 2000为3山／孔转染5小时作为最佳转染条件。qPCR检测各干扰siRNA组对靶基因的沉默效果,最终确定选用干扰siRNA抑制靶基因PCAF表达效果最佳为PCAF siRNA 002组,抑制效率为72%。琼脂糖凝胶电泳行电泳观察,在150bp处出现目的基因产物电泳带图像,条带清晰完整,片段大小与位置与干扰前预期一致,判定目的基因PCAF扩增成功。3).免疫细胞化学染色检测β-catenin蛋白的表达部位发现：相较于对照组,实验组SW13细胞中β-catenin蛋白表达减少,并且异位核表达明显减少；荧光素酶活性检测：与对照组相比,PCAF-siRNA实验组处理的SW13细胞TCF报告荧光信号的相对荧光强度明显减弱,为9.53±1.92,而对照组相对荧光强度为15.41±1.24。差异具有统计学意义(P<0.05); qPCR检测组间β-catenin表达差异发现实验组细胞的β-catenin表达量明显少于对照组和正常组,结果具有统计学意义(P<0.05)；分别提取各组SW13细胞总蛋白及核蛋白行Western blot检测,相对于正常组及对照组,实验组(PCAF-siRNA) SW13细胞总蛋白的β-catenin蛋白表达明显降低(P<0.05),正常组与对照组无显著差异(P>0.05),而上述结果同样与核蛋白中β-catenin的表达结果一致。4).qPCR检测各组转染细胞Wnt/β-catenin通路下游靶基因表达：发现相对于对照组,实验组中Cyclin D1、c-myc、CD44、MMP-7、PPAR-γ及VEGF基因表达下调,差异具有统计学意义(P<0.05),而Survivin及TCF-1基因表达差异无统计学意义(P>0.05); Western blot检测对比实验组PCAF-siRNA与对照组NC-siRNA比较发现：Cyclin D1、CD44、MMP-7、PPAR-γ以及VEGF蛋白表达差异具有统计学意义(P<0.05),与qPCR检测结果一致,而c-myc蛋白在Western blot检测在两组间的差异无统计学差异(P>0.05)。[结论]1).PCAF在肾上腺皮质癌组织中高表达,与E-caherin及Vimentin明显相关,可能参与肾上腺皮质癌EMT过程的发生、发展,β-catenin核内聚集在肾上腺皮质癌病理切片明显较肾上腺腺瘤组和正常组织组增多,为肾上腺皮质癌细胞Wnt/β-catenin信号通路的体外实验研究提供临床依据。2).抑制PCAF表达,引起肾上腺皮质癌细胞β-catenin异位表达减少,并使SW13细胞中Wnt/β-catenin信号通路活性降低。3).下调PCAF表达,引起Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因Cyclin D1、MMP-7、PPAR-γ以及VEGF表达下调,PCAF可能通过Wnt/β-catenin信号途径作为促癌基因参与到肾上腺皮质癌的发生、发展当中。