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目的:本课题首先以广西道地中药材两面针作为研究对象,比较不同产地两面针药材红外光谱图的差异及建立产地鉴别模型;比较分析生长周期中的两面针药材红外光谱的差异并研究其动态累积过程中化学成分的变化;在红外化学指纹图谱和生物活性之间建立谱效关系,以实现化学成分与生物活性之间的统一。同时,将单细胞光镊拉曼光谱技术用于两面针抗肝癌活性研究具有重要的临床应用意义。 方法:1.基于傅里叶变换红外光谱(FTIR)技术,分别采用多种方法对两面针的红外光谱数据进行校正后,利用SIMCA聚类分析法及Fisher比值法建立产地分类模型。2.测定不同采收期的两面针甲醇提取物的红外谱图,选取1800~500cm-1红外指纹图谱进行比较分析,结合高效液相法测定的不同采收期的两面针甲醇提取物中氯化两面针碱的含量为对照,研究两面针药材在生长周期中的化学成分的变化。3.基于不同产地的两面针氯仿提取物的红外指纹图谱特征峰强度及其抗肿瘤活性的效果,采用后退法构建以两面针抑制人肝癌细胞株BEL-7404和HepG-2两种肿瘤细胞株的谱效模型。4.采用两面针氯仿提取物中的活性成分对肝癌细胞处理12h,24h,36h,48h,并利用显微拉曼光谱系统测定两面针药物处理后不同时间段的细胞的光谱变化,并结合化学计量学方法对光谱数据进行处理和分析,以期揭示光谱学变化所反映的生物学内涵,促进中药两面针中的有效成分诱导肝癌细胞凋亡的生理过程的深入理解。 结果:1.不同产地的两面针红外光谱分别通过多元散射校正和标准正态变换,均是两面针产地模型鉴别研究的理想校正方法。通过建立SIMCA模式识别,所建立的模型基本能够正确识别4个不同产地的两面针样品,其鉴定结果的识别率和拒绝率均达到90%以上。通过 Fisher比值法将建模过程通过自编程序,还可将模式识别模型实现实时在线检测与快速鉴别样品。2.红外光谱提供了两面针药材甲醇提取物中主要官能团的吸收情况,可以较好的反应两面针中物质的类别情况,并且对照高效液相测定结果,二者反映两面针在动态累积过程中化学成分的变化结果基本一致。3.采用后退法建立多元线性回归方程,红外光谱中14个指纹峰,有9个对 BEL-7404细胞株的谱效方程有显著贡献(P<0.05),BEL-7404的谱效关系式为:Y=-17.724+35.605X2-30.389X3+69.026X4+16.856X5-85.202X6+39.620X9+11.949X10-26.533 X11-40.707 X14(P<0.05 R=0.932)有8个对HepG-2细胞株的谱效方程有显著贡献(P<0.05),HepG-2细胞株的谱效关系式为:Y=43.102+23.200X2-30.999X3+31.077X4-27.450X5+29.374X7-35.692X12+113.295X13-98.063X14(P<0.05 R=0.915)经过7批药材验证,谱效关系式的计算值和实际值的偏差率不超过10%,表明谱效关系式可用于预测两面针药材的抗肝癌药效作用。4.拉曼测定细胞光谱的结果显示,肝癌细胞BEL-7404在两面针氯仿提取物作用后,细胞发生凋亡,细胞中的核酸,蛋白质等重要生物分子在结构和含量上都发生了不同程度的改变,反映了肝癌细胞中核酸和蛋白质含量的谱峰随药物处理时间的延长而显著降低,表明凋亡的肝癌细胞中核酸和蛋白质的含量均低于活细胞,并与药物处理时间呈一定的相关性。 结论:1.多元散射校正和标准正态变换,均是两面针产地模型鉴别研究的理想校正方法。采用自编计算程序及现有统计软件,还可将模式识别模型实现实时在线检测与快速鉴别样品,大大提高了鉴别速度而更加具有应用价值。2.两面针甲醇提取物的红外图谱,能客观的反应复杂体系中化学成分,体现其动态累积过程,并且这种方法较为客观、可靠。3.两面针红外指纹图谱和两面针抗肿瘤活性之间具有相关性,且生物碱类成分在两面针抗肿瘤药效活性中发挥了重要的作用。4.两面针氯仿提取物能诱导肝癌细胞凋亡,其细胞凋亡过程中核酸和蛋白质的含量均低于活细胞,并与两面针药物处理时间呈一定的相关性。