淀粉是高等植物体内最主要的碳储存形式,叶绿体中淀粉的降解与磷酸酶密切相关。DSP4就是结合在叶绿体淀粉表面上最重要的磷酸酶之一。它含有一个C-末端催化结构域（PTP）和一个N-末端淀粉结合域（SBD）。PTP结构域主要起去磷酸化作用,SBD主要参与淀粉颗粒的结合。DSP4是目前为止发现的双特异性磷酸酶（DSPs）家族中唯一能直接影响淀粉颗粒形态结构的酶。研究表明,野生型拟南芥（WT）中淀粉颗粒呈扁平椭圆状,而淀粉过量表达突变体dsp4中由于敲除了DSP4,其叶淀粉颗粒偏圆形,颗粒直径明显变大。目前关于DSP4的结构和性质,尤其是其SBD的结构和性质,包括其如何与淀粉结合并调控淀粉颗粒降解的过程并不清楚,参与淀粉结合的氨基酸残基位点亦鲜有研究。 本课题根据DSP4的基因序列信息,通过对TAIR.PDB等数据库进行BLAST搜索和数据统计分析、Clustal X多序列比对,得到与DSP4 SBD相似度最高的结构模板——AMPKβ2的GBD（糖原结合域）,其PDB ID为2F15。根据同源建模的原理,利用MODELLER 9v6建立了DSP4 SBD的3D模型,预测了模型中的淀粉结合位点和钙离子结合位点。该结构模型具有典型的C2-结构域特征,含有3个碳水化合物结合域（CBR1～3）.其中CBR3含有2个与淀粉结合紧密相关的氨基酸残基位点（D311、E313）,且D311和E313还参与构成了SBD结构中的Ca2+结合位点Site I. 在In vitro实验中,分别突变CBR3区域内的位点D311、E313为中性氨基酸A,同时设置非CBR3区域内的定点突变E305A、D328A以及具有100%进化保守性的定点突变W314S为对照,并利用Escherichia coli异源表达纯化了这几种突变型DSP4。纯化后的突变型DSP4分成两组进行淀粉结合实验：其中一组直接与淀粉颗粒进行孵育,从而对比考察野生型与突变型DSP4的活性；另一组在淀粉孵育缓冲液中额外添加不同浓度Ca2+,用以研究钙离子对突变型DSP4淀粉结合能力的影响。Western blot结果显示：与野生型DSP4相比,突变型E305A与淀粉结合的能力未受到明显影响,突变型D328A的酶活则降低,突变型D311A、E313A、W314S的淀粉结合能力完全丧失,表明位点D311、E313、W314对维持DSP4与淀粉的结合至关重要。当在淀粉孵育缓冲液中补加5mM的Ca2+时,位点D311、E313、W314被突变后的突变型DSP4能重新获得绝大部分淀粉结合能力,表明Ca2+有助于DSP4与淀粉的结合。 在In vivo实验中,将D311、E313、W314分别被定点突变后的DSP4基因与GFP基因在拟南芥突变体dsp4中融合表达,构建了转基因植株GFP::D311A/dsp4、GFP::E313A/dsp4和GFP::W314S/dsp4,同时还构建了GFP::DSP4/dsp4作为阳性对照。荧光显微镜检测结果显示：与阳性对照植株GFP::DSP4/dsp4中提取的叶淀粉颗粒能检测到明亮的GFP荧光相比,从GFP::D311A/dsp4、GFP::E313A/dsp4和GFP::W314S/dsp4中分离纯化的淀粉颗粒没有观察到明显的GFP荧光,这与In vitro淀粉孵育实验结果一致,从而进一步验证了D311、E313确实是DSP4 SBD中直接参与淀粉结合的氨基酸位点。通过扫描电子显微镜（SEM）对淀粉颗粒形态结构进行观测,发现GFP::D311A/dsp4和GFP::E313A/dsp4中的叶淀粉颗粒形态几乎没有变化,与野生型淀粉颗粒一样呈现出扁平椭圆形,颗粒较小,并未如dsp4的淀粉颗粒一样偏大,且为圆形,表明DSP4中的氨基酸位点D311和E313与淀粉颗粒的形态无关。 本研究深化了对DSP4结构和功能的认识,为进一步阐明淀粉的降解过程奠定了基础。