背景及目的:内含肽（Intein）是位于前体未成熟蛋白中的一段具有自我剪接功能的多肽序列。相比连续型内含肽,断裂内含肽具有抑制不可控的提前剪接、剪切的天然优势,常被用于蛋白质纯化、蛋白质连接、毒素蛋白的生产等领域。Npu DnaE是一种来源于念珠藻（Nostoc punctiforme,Npu）的断裂型内含肽,具有高效、快速的蛋白质反式剪接活性。一些研究在Npu DnaE中引入D118G突变,获得了巯基化合物依赖性的C端剪切突变体,并在此基础上开发了快速蛋白纯化系统（Split intein Mediated Ultra-Rapid Purification of Tagless Protein,SIRP）,展现出了Npu DnaE内含肽在蛋白质标签纯化领域的巨大应用潜力。Npu DnaE介导的蛋白质C端剪切及反式剪接反应,高度依赖于还原剂的催化,这可能与其分子内的半胱氨酸易形成二硫键相关。本研究构建了N段无半胱氨酸的突变体Npu NC28SC59S-H和Npu NC28IC59R-H,并研究了其C端蛋白剪切反应与DTT催化的关系。文献报道,Npu DnaE的C段融合蛋白在表达纯化过程中会发生降解,这一缺陷将影响前体蛋白收率和产物纯度,进而增加了目的蛋白特别是药用重组蛋白的生产成本。本研究从Npu N和Npu C重构机制出发,构建N端融合Npu N2片段的Npu C延长突变体N2C,研究此突变体在原核表达系统中对Npu C片段的酶解稳定性的提升作用,并探讨其对剪切反应活性的影响。方法:本研究中,我们以分子生物学实验为手段,对Npu DnaE的N段和C段进行改造,以p ET28a、p ET30a为载体构建重组表达质粒,以大肠埃希菌BL21（DE3）作为表达的宿主细胞,采用一步或多步亲和层析方法进行重组蛋白纯化,采用离子交换层析法或超滤法进行蛋白质浓缩和置换反应缓冲液。经Bradford法测定浓度后,进行内含肽的剪切反应。通过SDS-PAGE凝胶电泳法和Western blot进行考察表达、纯化中Npu C段融合蛋白的稳定性,以及剪切反应结果。结果:实验中构建的纯化标签在C末端,N段无半胱氨酸的C端剪切型Npu DnaE突变体,Npu NC28SC59S-H、Npu NC28IC59R-H,在不依赖还原剂的条件下介导的快速的C端剪切反应:25℃无DTT催化下,20分钟产物生成率达50%,12小时后产率达90%。实验中构建的N段融合Npu N2片段的Npu C延长变体N2C,能显著提升了Npu C段重组蛋白表达纯化过程中的稳定性,同时与Npu N段能发生快速、高效的C端剪切反应:37℃条件,1 mmol/L DTT催化,10分钟产物生成率达到70%,30分钟达90%以上。影响C段剪切反应因素如温度、N/C比例、DTT浓度等因素考察结果显示,在考查条件下N2C延长变体内含肽的剪切反应均可以很好进行。