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田鼠巴贝斯虫(Babesia microti)是最重要的人兽共患巴贝斯虫之一,经蜱传播,寄生于宿主红细胞中。目前,防控巴贝斯虫病仍缺少疫苗和高效药物,了解虫体与宿主的互作机制,研发新型防治技术已刻不容缓。外泌体是一种可携带蛋白质、RNA和脂质等多种生物活性物质的膜性小囊泡,可以介导免疫调节、细胞迁移和细胞间通讯等功能。目前已有多种寄生虫外泌体在寄生虫-宿主互作中发挥重要作用的研究被报道,然而巴贝斯虫外泌体研究仍基本为空白。因此对田鼠巴贝斯虫外泌体的研究为深入解析巴贝斯虫与宿主互作机制提供基础。此外,B.nicroti寄生于宿主红细胞中,必然暴露于活性氧簇(reactive oxygen species,ROS),虫体依赖硫氧还蛋白系统抵抗宿主的氧化作用。硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)是一种广泛存在于原核生物和真核生物中的小分子蛋白质,它和硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase,TrxR)、NADPH共同构成了硫氧还蛋白系统,是硫氧还蛋白系统的重要组成部分。已有研究表明恶性疟原虫(Plasmodium farciparum)Trx2和TrxR分子都是潜在有效的药物靶标分子,而B.microti Trx的相关研究尚未见任何报道。因此对B.microti Trx分子功能研究可为了解巴贝斯虫的硫氧还蛋白系统分子机制,发现药物靶点提供基础。1.田鼠巴贝斯虫外泌体的分离和鉴定本章研究旨在对红细胞期田鼠巴贝斯虫外泌体(BmExo)进行分离和分子鉴定。首先,我们建立了红细胞期B.microti短期体外培养平台,之后收集30%染虫率的小鼠红细胞培养12h上清液,应用差速超速离心法分离出BmExo。应用透射电镜(Transmission Electron Microscopy,TEM)观察磷钨酸负染的外泌体,可见直径约为110nm的典型杯托状囊泡结构;纳米颗粒跟踪分析(Nano-particalTracking Analysis,NTA)结果显示分离到的外泌体粒径为127.7±41.9 nm,浓度为1.62±0.17×109个/毫升;Western Blot分析结果显示,感染B.microti的小鼠高免血清能够从BmExo总蛋白中识别出15个特异性条带,表明BmExo中携带有多种免疫原性强的蛋白分子。随后,我们对BmExo总蛋白进行鸟枪-串联质谱(Shotgun LC-MS/MS)鉴定,搜Uniprot B.microti蛋白数据库,共有207种蛋白被鉴定,其中包含 Actin,Tubulin,Heat Shock protein 20(HSP20),HSP70,GAPDH,Enolase,Aldolase,Lactate dehydrogenase(LDH),Elongation factors(EF),RAP protein,Rab protein,Phosphoglyceratekinase(PK)等常见外泌体标志蛋白分子(基于 Exocarta数据库);Surface Antigen(S A),Apical Membrane Antigen 1(AMA1)等多种分泌抗原基因;Enolase,Aldolase,LDH,PK等多种酶分子;此外尚包含多种未经注释的蛋白。对BmExo总蛋白进行生物信息学分析,Gene Ontology分析结果显示,生物学过程(BiologicalProcess)分析中大多数蛋白参与metabolicprocess(30%),cellular process(3 0%),single-organism process(23%),localization(6%),biological regulation(6%),cellular component organization or biogenesis(3%),response to stimulus(3%)等过程;分子功能(MolecularFunction)分析中蛋白功能主要集中于 binding(46%),catalytic activity(41%),transporter activity(6%),structural molecule activity(5%);细胞组分(Cell Component)分析中蛋白主要组成 cell(25%),cell part(24%),organelle(14%),macromolecular complex(13%),membrane(10%),organelle part(7%),membrane part(7%)。外泌体及其携带的重要蛋白分子的功能尚有待进一步研究。本研究为深入解析巴贝斯虫与宿主的互作机制提供基础。2.田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白2的表达特性和功能研究本研究应用已构建好的重组表达质粒pET-30a(+)-Trx2体外表达、纯化重组BmTrx2蛋白并制备小鼠抗BmTrx2多克隆抗体。应用qRT-PCR和Western blot方法检测了 BmTrx2基因的表达谱,应用免疫荧光试验检测BmTrx2基因在田鼠巴贝斯虫虫体中的定位,应用qRT-PCR方法检测了 BmTrx2基因对不同浓度抗原虫药物作用的应答。试验结果显示重组BmTrx2蛋白大小约为15.5kDa;感染田鼠巴贝斯虫21天的小鼠血清可以特异性识别大小约为15.5 kDa的重组BmTrx2蛋白,而小鼠抗BmTrx2多克隆抗体可以从田鼠巴贝斯虫裂殖子总蛋白中特异性识别天然BmTrx2蛋白;小鼠感染田鼠巴贝斯虫后,BmTrx2基因的转录水平在第3天达到峰值,在第7天骤然下降,而后在第8天达到另一个峰值,之后又骤然下降至低水平;应用不同浓度双氢青蒿素、克林霉素或奎宁作用之后,BmTrx2的转录水平得到显著提高,而氯喹试验组BmTrx2的转录水平没有任何显著变化;免疫荧光试验结果表明BmTrx2基因在田鼠巴贝斯虫裂殖子细胞质中表达,围绕细胞核分布。综上结果表明BmTrx2基因是存在于田鼠巴贝斯虫中的重要抗氧化酶,可能参与抗原虫药物的应答过程。以上研究为治疗和预防田鼠巴贝斯虫引发的巴贝斯虫病提供理论参考。3.田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白3的表达特性和功能研究本章研究应用已构建好的重组表达质粒pET-30a(+)-Trx3体外表达、纯化重组BmTrx3蛋白并制备小鼠抗BmTrx3多克隆抗体。应用qRT-PCR和Western blot方法检测了 BmTrx3基因的表达谱,应用免疫荧光试验检测BmTrx3基因在田鼠巴贝斯虫虫体中的定位,应用qRT-PCR方法检测了 BmTrx3基因对不同浓度抗原虫药物作用的应答。试验结果显示重组BmTrx3蛋白大小约为22kDa;感染田鼠巴贝斯虫21天的小鼠血清可以特异性识别大小约为22kDa的重组BmTrx3蛋白,而小鼠抗BmTrx3多克隆抗体可以从田鼠巴贝斯虫裂殖子总蛋白中特异性识别天然BmTrx3蛋白;小鼠感染田鼠巴贝斯虫后,BmTrx3基因的转录水平在第3天达到峰值,在第7天骤然下降,而后在第8天达到另一个峰值,之后又骤然下降至低水平;应用不同浓度克林霉素或奎宁作用之后,BmTrx3的转录水平得到显著提高,而不同浓度的氯喹作用之后,BmTrx3的转录水平被显著下调,双氩青蒿素试验组没有检测到BmTrx3的转录水平有任何显著变化;免疫荧光试验结果表明BmTrx3基因在田鼠巴贝斯虫裂殖子细胞质中表达,围绕细胞核分布。综上结果表明BmTrx3基因是存在于田鼠巴贝斯虫中的重要抗氧化酶,可能参与抗原虫药物的应答过程。以上研究为治疗和预防田鼠巴贝斯虫引发的巴贝斯虫病提供理论参考。