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鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus,DEV)又称鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV),是阻碍养鸭业健康发展的重要病原之一。实验室前期研究发现了DEV核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,NP)及其宿主细胞受体即蛋白激酶C抑制蛋白(Protein kinase C inhibitor,PKCI)。PKCI是宿主细胞内蛋白激酶C(Protein kinase C,PKC)的抑制蛋白质,PKC是宿主细胞磷酸化通路的关键分子,参与多种病毒的增殖过程。但宿主细胞磷酸化通路是否影响DEV侵染过程,尚无文献报道。为此,本研究利用PKC经典抑制剂(Staurosporine,SP)和专性激活剂(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)开展磷酸化通路在DEV感染中的作用研究,以期为阐明DEV侵染机理提供一些新的线索和思路。1.鸭源PKC基因荧光定量PCR检测方法的建立:根据GenBank上PKC基因设计和合成特异性引物,通过PCR扩增从鸭胚成纤维(DEF)细胞mRNA提取样本中获取目的基因片段,构建重组质粒GV pXT19-T-PKC,并以其为阳性标准品建立荧光定量PCR检测方法和标准曲线,然后进行重复性、特异性和敏感性验证,结果显示:荧光定量PCR标准曲线的线性关系为Y=-3.3340x+44.199,相关系数为0.9954,扩增效率为99.19%;熔解曲线仅出现单特异峰,对H5亚型AIV、H7亚型AIV、H9亚型AIV、NDV和DHV均未检测到荧光信号。这表明本试验建立的荧光定量PCR方法具有良好的稳定性、特异性和灵敏性。2.SP和PMA对DEV毒力的影响:取DEV贵州强毒株,接种DEF细胞,测定TCID50值;取培养成单层的DEF细胞,分别用SP和PMA(浓度均为100nmol/L)处理4h,分别加入系列稀释的DEV进行孵育,观察和测定TCID50值变化;分别以不同浓度的SP和PMA处理DEF细胞后,再加入0.01MOI的DEV进行孵育,观察和分析病毒TCID50值变化,结果:DEV贵州强毒株的TCID50值为3.16×10-9/0.1mL;经SP处理,随处理浓度的加大,病毒TCID50值随之下降,但浓度到100nmol/L时,病毒TCID50值回升;经PMA处理,在20至50nmol/L时病毒TCID50值随之上升,但到100至200nmol/L时,病毒TCID50值反而下降。这表明经SP和PMA处理,可影响DEV毒力即DEV的增殖。3.SP和PMA对PKC、PKCI和DEV-NP基因转录的影响:取培养成单层的DEF细胞,经SP和PMA处理后,再用DEV感染,然后收集细胞培养物,应用前期建立的荧光定量PCR方法检测分析PKC、PKCI和DEV-NP基因的转录水平,结果:SP处理组PKC、PKCI和DEV-NP基因的转录水平分别为2.62×109copies/μL、2.61×102copies/μL和6.65×100copies/μL;PMA处理组相应为3.92×108copies/μL、5.24×101copies/μL和2.55×108copies/μL;病毒对照组相应为8.11×106copies/μL、5.83×101copies/μL和2.74×102copies/μL。这表明,SP处理能降低DEV增殖水平,而PMA处理能提高DEV增殖水平。