1、研究背景:多囊卵巢综合征(PCOS)是最常见的女性内分泌和代谢紊乱疾病之一,而且经常伴有胰岛素抵抗(IR)和肥胖症。在过去的十年中,肌醇被引入到PCOS的治疗中。肌醇是一种糖醇和一种葡萄糖异构体,存在于许多食品中,包括谷物和水果。肌醇是众多继发性信使的前体,曾经被认为是B族维生素之一,它可以降低PCOS妇女的胰岛素抵抗状态并改善卵巢功能和降低雄激素水平。肌醇在改善脂代谢异常方面也获得了很好的疗效,已有大量研究发现肌醇可以用于治疗多囊卵巢综合征,并可以改善胰岛素抵抗,提高PCOS患者卵母细胞质量,改善妊娠结局。然而肌醇改善胰岛素抵抗促进良好结局的机制尚不明确。大量研究证明高脂饲料可以诱导胰岛素抵抗的动物模型,在高脂饲料所诱导的非酒精性脂肪肝和PCOS胰岛素抵抗模型中都发现了游离脂肪酸和IL-6的升高,游离脂肪酸可以促进IL-6的表达,说明高脂饲料所导致的游离脂肪酸和IL-6升高在胰岛素抵抗发病机制中起到了重要作用。慢性低度炎症在PCOS发病机理中起着至关重要的作用。与没有患该病的女性相比,患有PCOS的女性的血清炎症因子(包括IL-6)水平显著增加。IL-6是慢性炎症中的主要促炎细胞因子,与慢性炎症密切相关。因此,炎症相关代谢疾病可能具有相同或相似的信号通路,而IL-6可能是PCOS中早期的低度慢性炎症标记的关键分子,IL-6激活转录活化因子3(STAT-3)在PCOS中起着重要作用。STAT-3活化后刺激miR-155表达,抑制STAT-3的磷酸化,将会抑制miR-155的表达,转录活化因子-3(STAT-3)的活化将会导致其下游分子miR-155表达的增加。关于胞外囊泡参与糖尿病的研究发现miR-155可以通过靶向作用PPAR-γ而参与胰岛素抵抗及糖尿病的发病机制。在PCOS患者中发现了 IL-6和miR-155的表达增加,其他实验也证明了 PCOS中IL-6促进STAT-3活化,而STAT-3下游分子miR-155靶向作用的PPAR-γ在PCOS中表达降低参与了胰岛素抵抗,鉴于高脂饲料可以增加PCOS血中游离脂肪酸(FFA)的浓度,而FFA又可以增加IL-6的表达,同时也有研究证实FFA和IL-6可以协同激活STAT-3,因此可以猜测,脂代谢异常所导致的胰岛素抵抗可能是由增高的游离脂肪酸(FFA)通过影响IL-6/STAT-3/miR-155/PPAR-γ通路实现的。此外,在PCOS大鼠模型及患者中都发现了卵巢自噬和卵巢血管异常生成明显增加,卵巢自噬和卵巢血管异常生成对卵泡发育及卵巢排卵作用重大。在多项研究自噬和血管生成的研究中都发现miR-155/PPAR-γ通路发挥了重要作用,此通路可以通过影响mTORC1、mTORC2和VEGF的表达影响自噬和血管生成。IL-6/STAT-3/miR-155/PPAR-γ通路可能同时调控PCOS胰岛素抵抗、卵巢自噬和异常血管生成。肌醇被发现可以降低IL-6表达,因此我们猜测,肌醇可能通过IL-6/STAT-3/miR-155/PPAR-γ通路发挥改善胰岛素抵抗的作用,同时影响卵巢自噬和卵巢血管生成。肌醇改善胰岛素抵抗的同时是否影响卵巢自噬和卵巢血管生成,IL-6/STAT-3/miR-155/PPAR-γ通路及其下游分子是否参与了 PCOS的胰岛素抵抗、卵巢自噬和异常血管生成的发病机制,肌醇的作用机制是否与该通路相关,回答这些问题,不仅可以进一步阐明肌醇改善PCOS胰岛素抵抗、影响卵巢自噬和异常血管生成的作用机制,而且可以对多囊卵巢综合征胰岛素抵抗以及其他的胰岛素抵抗相关疾病的治疗提供新的思路和理论依据。2、研究目的本研究构建了多囊卵巢综合征胰岛素抵抗的大鼠模型,并予肌醇干预,从大鼠的卵巢、脂肪以及肝脏三种组织探讨药物肌醇改善多囊卵巢综合征胰岛素抵抗的作用,并基于IL-6/STAT-3/miR-155/PPAR-γ通路探讨肌醇改善胰岛素抵抗的机制,此外还探讨了肌醇改善胰岛素抵抗的同时对多囊卵巢综合征卵巢自噬和卵巢血管的影响及作用机制。3、研究方法20只Sprague-Dawley雌性鼠(3-4周龄),用于检验PCOS大鼠模型构建。随机分为2组(每组n=10,PCOS组用于制造多囊卵巢综合征合并胰岛素抵抗大鼠模型,Control组正常饮食作为空白对照组。PCOS-IR大鼠模型喂食高脂饲料(HFD)8周,在喂食方案的最后4周予以来曲唑。采用HE染色检测两组大鼠卵巢的形态结构,应用试剂盒检测游离脂肪酸,应用ELISA法检测了性激素、胰岛素和IL-6的表达,应用电子显微镜检测了胞外囊泡。应用RT-PCR检测胞外囊泡内miR155和miR-21的表达以及卵巢组织中PPAR-γ mRNA和GLUT4 mRNA的表达。为了探索肌醇改善胰岛素抵抗的作用及机制,我们将45只Sprague-Dawley雌性鼠(3-4周龄),随机分为3组(每组n=15,各组大鼠饲养在同一环境中的两个笼子中),阴性对照组(正常饮食,生理盐水干预),PCOS组(高脂饲料和来曲唑造模,生理盐水干预)和肌醇组(高脂饲料和来曲唑造模,造模成功后肌醇干预4周)。采用HE染色检测卵巢的形态结构,应用试剂盒检测甘油三酯、胆固醇、游离脂肪酸的水平,应用ELISA法检测了性激素、胰岛素、IL-6及血管内皮生长因子的表达,应用电子显微镜检测了自噬小体和胞外囊泡。应用CD31标记卵巢血管,显微镜观察卵巢血管的变化。应用免疫组化检测了 IL-6、STAT-3、p-STAT-3的表达,应用免疫荧光染色法检测了 LC3、PPAR-γ和GLUT4的表达,应用 RT-PCR检测 miR155、miR-21,PPAR-γ mRNA 和 GLUT4 mRNA 的表达,并使用 Western blot 检测了 IL-6、STAT-3、p-STAT-3、PPAR-γ、GLUT4、LC3、mTORC1 和 mTORC2 的表达。4、研究结果1.予高脂饲料和来曲唑造模后,卵巢HE染色结果提示PCOS模型组大鼠卵巢成多囊改变,对照组的HOMA-IR指数为2.09±0.64,而PCOS模型组的HOMA-IR指数为4.55±0.49,两组具有明显差异(P<0.01)。两组之间的卵泡刺激素(FSH)浓度没有显著差异(P=0.213),血清黄体生成素(LH)、雄激素(T)、LH/FSH比值、游离脂肪酸和IL-6浓度在PCOS模型组明显增加。免疫荧光法检测结果提示PPAR-γ及GLUT4在PCOS模型组表达明显增多,PCOS模型组大鼠卵巢组织中PPAR-γ mRNA及GLUT4 mRNA的表达显著低于空白对照组(P<0.01)。2.予肌醇干预PCOS-IR模型大鼠的实验发现:在食物摄入量和体重方面,PCOS组大鼠明显高于肌醇组和空白对照组(P<0.01)。PCOS组大鼠的血清黄体生成素(LH)、雄激素(T)和LH/FSH 比值明显高于空白对照组和肌醇组(P<0.01)。PCOS组大鼠的血清E2浓度明显低于空白对照组和肌醇组的E2水平(P<0.01)。而三组之间的卵泡刺激素(FSH)水平没有显著差异(P=0.157)。阴性对照组和肌醇组大鼠HOMA-IR指数分别为2.15±0.59和2.27±0.79,而PCOS模型组的 HOMA-IR 指数为 4.22±0.77(P<0.01)。3.在PCOS组的大鼠卵巢组织中观察到多囊性改变。相反,肌醇组和空白对照组卵巢结构未见明显的多囊性改变。PCOS组的甘油三酯、VEGF和IL-6血清浓度显著高于阴性对照组和肌醇组(P<0.01),而三组间并未观察到胆固醇血清水平的显著差异。4.RT-PCR检测PCOS-IR大鼠卵巢中miR-155,miR-21,IL-6和PPARmRNA的表达,与PCOS组相比,空白对照组和肌醇组大鼠卵巢组织中PPAR-γ mRNA的表达明显高于PCOS组,而大鼠卵巢组织中miR-155,miR-21和IL-6 mRNA表达明显低于PCOS组(P<0.01)。5.免疫组织化学法、免疫荧光法及western blot检测卵巢组织中的蛋白表达结果提示:PCOS组中IL-6和p-STAT-3的表达明显高于肌醇和空白对照组(P<0.01),而补充肌醇后不影响STAT-3的表达。但是,PCOS组大鼠卵巢组织中PPAR-γ和GLUT4的表达明显低于肌醇组和空白对照组(P<0.01)。6.通过免疫荧光显微镜检测了卵巢组织细胞内LC-3的表达情况发现:在PCOS组,卵巢颗粒细胞LC-3的表达的荧光信号明显强于肌醇组和空白对照。Western blot检测LC3结果提示卵巢组织中LC3-II/LC3-I的比值在PCOS组明显高于肌醇组和空白对照组(P<0.01)。相比于空白对照组和肌醇组,PCOS组卵巢组织中mTORC1和mTORC2的表达明显减少(P<0.01)。7.应用CD31标记卵巢血管后观察卵巢血管生成情况,结果提示PCOS组卵巢间质中血管丰富,而在肌醇组和空白对照组,卵巢间质血管少于PCOS组。8.Western blot 检测脂肪组织中 IL-6、STAT-3、p-STAT-3 和 PPAR-γ 的蛋白表达情况,结果提示,PCOS组大鼠脂肪组织中IL-6和p-STAT-3的表达明显高于肌醇组和空白对照组,此外三组大鼠的脂肪组织中STAT-3的表达水平无明显差异,PPAR-γ在PCOS-IR组大鼠脂肪组织中的表达明显少于肌醇组和空白对照组(P<0.01)。9.PCOS组大鼠脂肪组织及血清胞外囊泡中miR-155和miR-21表达明显高于肌醇组和空白对照组(P<0.01)。检测大鼠血清中血管内皮生长因子(VEGF)和游离脂肪酸(FFA)浓度结果提示PCOS组大鼠血清中血管内皮生长因子(VEGF)和游离脂肪酸(FFA)浓度显著高于肌醇组和空白对照组(P<0.01)。10.HE染色检测肝脏的结果发现:在PCOS组大鼠的肝脏组织内见到大量的脂肪液滴堆积,而且肌醇组大鼠肝脏细胞周围的脂肪液滴明显减少,空白对照组大鼠肝脏组织中则未见明显脂肪液滴。在PCOS组大鼠肝脏组织中PPAR-γ mRNA和GLUT4 mRNA表达明显低于肌醇组和空白对照(P<0.01)。5、研究结论1.高脂饲料和来曲唑可以成功诱导多囊卵巢综合征胰岛素抵抗(PCOS-IR)大鼠模型,血中游离脂肪酸(FFA)浓度、IL-6浓度和胞外囊泡中miR-155表达的升高在PCOS大鼠胰岛素抵抗中起到了重要作用,卵巢组织中PPAR-γ和GLUT4的表达降低参与了 PCOS-IR模型大鼠卵巢组织的局部胰岛素抵抗。2.补充肌醇可以改善多囊卵巢综合征胰岛素抵抗,高脂饲料和来曲唑干预诱导的多囊卵巢综合征胰岛素抵抗大鼠模型中卵巢组织存在局部胰岛素抵抗,补充肌醇可以改善卵巢组织的局部胰岛素,肌醇改善卵巢组织胰岛素抵抗的作用机制与 IL-6/STAT-3/miR-155/PPAR-γ 通路中 IL-6、磷酸化 STAT-3、miR-155 的表达降低和PPAR-γ表达增加相关。3.高脂饲料和来曲唑诱导的多囊卵巢综合征胰岛素抵抗(PCOS-IR)大鼠模型中卵巢自噬明显增加,其机制与卵巢组织mTORC1和mTORC2表达降低相关,而补充肌醇可以通过增加mTORC1和mTORC2的表达减少卵巢自噬。4.高脂饲料和来曲唑诱导的多囊卵巢综合征胰岛素抵抗(PCOS-IR)大鼠模型卵巢间质血管明显增多,而补充肌醇后卵巢间质血管减少,肌醇的该作用机制与卵巢组织内mTORC1表达增加和血中VEGF浓度降低相关。5.高脂饲料和来曲唑干预诱导的多囊卵巢综合征胰岛素抵抗大鼠模型中脂肪组织存在局部胰岛素抵抗,补充肌醇可以改善脂肪组织的局部胰岛素,肌醇改善脂肪胰岛素抵抗的作用机制与FFA/IL-6/STAT-3/miR-155/PPAR-γ通路中FFA浓度降低,脂肪组织中IL-6、磷酸化STAT-3、miR-155的表达降低和脂肪组织中PPAR-γ表达增加相关。6.高脂饲料和来曲唑干预诱导的多囊卵巢综合征胰岛素抵抗大鼠模型中肝脏组织存在局部胰岛素抵抗,补充肌醇可以改善肝脏组织的局部胰岛素抵抗,肌醇改善肝脏胰岛素抵抗的作用机制与胞外囊泡内miR-155表达降低和肝脏组织内PPAR-γ和GLUT4的表达增加相关。