β-葡聚糖酶作为一类重要的半纤维素酶,被广泛应用于食品、饲料等行业,但其在热环境下的弱稳定性限制了应用潜力。为获得热稳定性好的β-葡聚糖酶,当前的研究热点主要集中在其基因挖掘和改良酶学性质。本文从微生物资源中克隆表达具有降解半纤维素潜力的GH16家族葡聚糖酶,分别从N-糖基化改造和理性设计的角度探究影响其热稳定性的因素,以期获得热稳定性好的突变体。主要研究结果如下:（1）从真菌Rhizopus homothallicus和Aspergillus tubingensis中分别获得两种新型GH16家族葡聚糖酶基因Rhglu16b和Atglu16d并在毕赤酵母中表达。来源于R.homothallicus的RhGlu16B最适温度为60℃,在65℃处理2 h保持50%以上的酶活。其最适pH为4.5,在pH 1.0-12.0范围内维持稳定,且比活高达9673 U/mg,属于典型的高比活酸性高温葡聚糖酶;来源于A.tubingensis的AtGlu16D最适pH和最适温度分别为4.0和45℃,在动物体温（40℃）下可保持85%以上的相对酶活。上述两种葡聚糖酶均能降解大麦葡聚糖、地衣多糖和昆布多糖等多种键型的葡聚糖,且对多数金属离子和有机溶剂具有较好的耐受性,因此改良其热稳定性在食品、饲料等领域具有良好的应用潜力。（2）明确增强GH16家族葡聚糖酶热稳定性的唯一N-糖基化位点N57。通过序列及结构分析,发现RhGlu16B在Loop（A55-G64）区的N57位发生N-糖基化,定点突变去除N-糖基化的突变体RhGlu16B-N57A的热稳定性显著降低（p＜0.05）。与野生型相比,其T50值（63℃）和Tm值（47.4℃）分别降低5.6℃和5.1℃。选择同家族的葡聚糖酶Bis Glu16B对该位点进行去除N-糖基化,突变体Bis Glu16B-N60A的T50和Tm值较野生型分别降低6.0℃和5.7℃;在此基础上选择同家族的葡聚糖酶Tl Glu16A在该位置引入N-糖基化进一步反向验证发现,N-糖基化后的突变体Tl Glu16A-A62T的热稳定性较野生型显著提升（p＜0.05）,其T50和Tm值较野生型分别提高3.0℃和6.4℃,65℃下的半衰期由32 min延长至54 min,且催化效率较野生型提高60.7%。以上结果表明,在GH16家族葡聚糖酶中当Loop（A55-G64）内发生N-糖基化时可有效提升酶的热稳定性,分子动力学模拟显示该位置引入N-糖基化可降低酶的均方根偏差（RMSD）,从而增强蛋白刚性。研究结果反映了N-糖基化对GH16家族葡聚糖酶结构稳定的重要性,为葡聚糖酶热稳定性的分子改良提供了重要参考。（3）理性设计明确了增强GH16家族葡聚糖酶AtGlu16D热稳定性的关键氨基酸位点D219。基于分子动力学模拟和虚拟饱和突变对β-葡聚糖酶AtGlu16D进行热稳定性改良,最终确定了与酶热稳定性相关的位点D219,获得了热稳定性提高的突变体D219R。与野生型比较,突变体D219R在50℃下的半衰期（71 min）提高16.8倍,T50值（61.0℃）提高12.5℃。其催化活力也有显著提升,当以昆布多糖为底物时突变体D219R的催化效率和比活性较野生型分别提高69.9%和54.2%。分子动力学模拟结果显示,突变点D219R通过降低蛋白RMSD来提升酶的热稳定性。该研究发现了GH16家族葡聚糖酶分子改良中兼顾热稳定性与催化活力的关键氨基酸残基,为葡聚糖酶的酶学性质改良提供理论参考。（4）热稳定性增强的GH16家族葡聚糖酶突变体Tl Glu16A-A62T和AtGlu16D-D219R在降解生物质、降低食糜粘度和提高饲料消化方面具有实用性。将两种突变体在40℃下协同商品化木聚糖酶降解预处理后的玉米芯,均能促进木聚糖酶对半纤维素的降解,其中Tl Glu16A-A62T的协同度最高达1.53。突变体Tl Glu16A-A62T可有效降低麦芽汁粘度（11.54%）,接近商业酶水平（15.66%）。两种突变体均可提高大麦型饲料中干物质的消化率,Tl Glu16A-A62T的干物质降解率（74.1%）达到商业酶（73.9%）水平。因此,突变体Tl Glu16A-A62T和AtGlu16D-D219R在生物质降解、啤酒酿造及饲料生产领域具有较大的应用潜力。综上,通过基因克隆表达获得新型GH16家族葡聚糖酶RhGlu16B和AtGlu16D,明确了N57位点的N-糖基化和氨基酸位点D219是影响GH16家族葡聚糖酶热稳定性的关键因素,且热稳定性增强的突变体Tl Glu16A-A62T和AtGlu16D-D219R可应用于生物质降解产糖、降低麦汁粘度及提高饲料消化率。研究结果为GH16家族葡聚糖酶的热稳定性改良提供了新思路,同时为工业生产提供了优良的候选用酶,具有重要的理论意义和应用价值。