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第一部分PIAS3在胃癌及癌旁非癌组织中的表达水平及临床意义目的:明确胃癌组织及癌旁非癌组织中PIAS3的表达水平,进一步关联患者临床病理参数及术后随访信息,阐明胃癌组织PIAS3表达与胃癌恶性生物学行为的关系,明确其预后指导意义。方法:回顾性分析2005年10月至2010年10月在我院接受根治性胃癌手术的130例患者信息。所有患者均未接受术前新辅助化疗,术后均接受氟尿嘧啶为基础的一线方案化疗至少6周期,患者术后每3个月定期进行规范复查,随访终止时间截止患者死亡,本组患者均随访获得明确死亡时间,无失访患者。临床收集血、尿、便常规,肝肾功能以及肿瘤标志物等生化结果,术前B型超声、腹部CT、胸部X线检查以及胃镜等影像学检查结果。应用免疫组织化学(IHC)方法检测130例胃癌根治术患者肿瘤标本中PIAS3和STAT3蛋白表达水平。收集其中10例胃癌患者肿瘤与癌旁非癌组织新鲜冰冻标本,利用Real-Time PCR、Western blot技术对PIAS3及STAT3(P-STAT3)的mRNA和蛋白表达水平进行检测。基于免疫组织化学PIAS3蛋白表达水平关联患者临床与病理信息,应用SPSS18.0软件进行统计分析。结果:1胃癌患者的一般情况:患者男女比例约为3.5:1,60岁以下患者约占46.92%,病理结果显示肿瘤浆膜浸润者占84.62%,有63.85%的患者出现淋巴转移。2胃癌患者肿瘤组织中PIAS3和STAT3蛋白的表达水平:免疫组化(IHC)结果显示,PIAS3蛋白表达的阳性信号主要定位于胞浆,呈黄色或棕黄色颗粒状,所有130例胃癌组织中95例为低表达(所占比例为73.08%),35例为高表达(所占比例26.92%)。STAT3蛋白表达的阳性信号主要定位于胞核,呈黄色或棕黄色颗粒状,所有130例胃癌组织中42例为低表达(所占比例为32.30%),88例为高表达(所占比例67.69%)。经统计学分析,肿瘤组织中PIAS3与STAT3蛋白表达水平呈现显著负相关关系(R=-0.656,P<0.001)3新鲜配对组织标本PIAS3和STAT3的表达水平:Western blot结果显示10例胃癌组织和相应癌旁非癌组织P-STAT3蛋白在肿瘤组织中的表达水平显著高于癌旁非癌组织(5.20±0.63 vs.1.00±0.36,P<0.05),肿瘤组织中P-STAT3蛋白的表达水平约为癌旁非癌组织的5.2倍。而PIAS3蛋白在肿瘤组织中的表达水平显著低于癌旁非癌组织(1.00±0.30 vs.3.15±0.43,P<0.05),肿瘤组织中PIAS3蛋白的表达水平约为癌旁非癌组织的1/3。Real-time PCR结果显示,随机抽取的10对胃癌组织和相应癌旁非癌组织STAT3 mRNA在肿瘤组织中的表达水平是癌旁非癌组织的2.05±0.21倍(P<0.05),而PIAS3 mRNA在癌旁非癌组织中的表达水平是肿瘤组织的2.48±0.43倍(P<0.05)。4胃癌患者的预后与PIAS3表达水平之间的关系:130例患者术后随访超过5年(其中术后生存最短12个月,最长126个月),患者术后生存期中位数为37.5个月(95%置信区间:18~79个月),在末次随访时尚有1位患者存活。分别对胃癌患者总体生存期和肿瘤部位、大小、分化、局部浸润情况、淋巴转移情况和PIAS3的表达水平(即免疫组化结果)进行关联分析,PIAS3的表达减低与胃癌的局部浸润及淋巴转移呈正相关。进一步应用单因素、多因素分析,结果显示PIAS3低表达(HR=4.801(2.892-7.970),P<0.001)、淋巴结转移(HR=1.725(1.152-2.584),P=0.008)以及Lauren分型(HR=1.514(1.074-2.133),P=0.018)是胃癌患者的术后独立预后因素。第二部分PIAS3通过限制STAT3活化抑制人胃癌细胞增殖与转移目的:通过病毒感染基因修饰技术,上调或下调胃癌细胞中PIAS3表达,观察细胞增殖、侵袭变化,探讨PIAS3参与胃癌细胞恶性生物学行为的内在分子机制。方法:体外培养观察人胃癌细胞系AGS、HGC-27、KATO-III以及人正常胃粘膜细胞系GES-1。利用实时定量PCR(Real-Time PCR)技术、western blot技术等分别对各细胞系中的STAT3和PIAS3的mRNA和蛋白表达水平进行检测;采用病毒感染基因修饰技术,构建上调或下调PIAS3的胃癌细胞稳系,应用MTT、EDU实验观察细胞存活及增殖能力,划痕实验、transwell检测细胞迁移侵袭能力。结果:1细胞系PIAS3/STAT3基础表达:PIAS3在正常胃黏膜GES-1细胞的相对表达量是2.75±0.13,而在AGS胃癌细胞系的表达是0.85±0.08,在HGC-27胃癌细胞系的表达是0.98±0.11,在KATO-III胃癌细胞系的表达是1.35±0.23;P-STAT3在正常胃黏膜GES-1细胞的相对表达量是0.38±0.06,而在AGS胃癌细胞系的表达是0.98±0.06,在HGC-27胃癌细胞系的表达是0.67±0.02,在KATO-III胃癌细胞系的表达是0.55±0.03。与GES-1正常胃粘膜细胞相比,胃癌细胞中PIAS3表达降低而STAT3活化(P-STAT3)增强。2应用慢病毒技术构建PIAS3稳定修饰胃癌细胞系,验证其对胃癌增殖迁移能力的影响:MTT结果显示,过表达PIAS3对胃癌细胞活性具有显著抑制作用,随培养时间的延长OD值增加,但不同时间点过表达PIAS3胃癌细胞的增殖程度均显著低于对照组胃癌细胞,差异具有统计学意义。Edu结果显示,与MTT相似的实验结果提示过表达PIAS3对胃癌细胞增殖能力具有显著抑制作用,而干扰PIAS3对胃癌细胞活性具有促进作用,差异均具有统计学意义(P<0.05)。划痕法检测显示,过表达PIAS3对胃癌细胞AGS的迁移能力具有显著抑制作用,而干扰PIAS3显著增强了胃癌细胞KATO-III细胞的迁移能力,差异均具有统计学意义(P<0.05)。Transwell实验结果显示(图11,12),过表达PIAS3对胃癌细胞AGS的侵袭迁移能力具有显著抑制作用,而干扰PIAS3显著增强了胃癌细胞KATO-III细胞的侵袭迁移能力,差异均具有统计学意义(P<0.05)。第三部分胃癌裸鼠移植瘤实验明确PIAS3体内抑瘤作用及其分子机制目的:通过构建稳定过表达PIAS3的胃癌细胞系,构建BALB/c Nude裸鼠皮下移植瘤模型,通过与稳转空载对照组细胞移植瘤比较,观察过表达PIAS3对肿瘤生长的影响。方法:体外稳转筛选并获得PIAS3高表达的胃癌癌细胞株AGS-PCDH-PIAS3,应用AGS-PCDH-PIAS3细胞和转染空质粒的癌细胞AGS-PCDH-Control构建BALB/c Nude裸鼠皮下移植瘤模型,观察裸鼠皮下肿物生长情况,动物饲养5周,处死小鼠收集肿瘤标本,应用连续切片免疫组化方法明确肿瘤组织PIAS3、STAT3以及Ki67的表达情况,以进一步验证PIAS3在肿瘤生长中的作用。结果:1胃癌皮下荷瘤小鼠一般情况:胃癌AGS稳定转染细胞在裸鼠皮下种植后,AGS-PCDH-Control组裸鼠体重逐渐下降(第35天平均体重14.3±5.2g),活动能力减弱,精神萎靡,皮肤表面逐渐长出肿物,与其相比,AGS-PCDH-PIAS3组裸鼠体重未见进行性下降(第35天平均体重体重19.3±3.5g),精神运动能力尚可,皮肤表面也逐渐长出肿物,但与对照组相比肿物生长较缓慢。2过表达PIAS3后能够抑制肿瘤移植瘤的生长:与转染空质粒组相比,第35天测量裸鼠皮下移植瘤大小,AGS-PCDH-PIAS3组肿瘤体积为(472.99±88.83mm3),显著小于AGS-PCDH-Control组(1748.39±204.39mm3),差异具有统计学意义(P<0.05)。3移植瘤组织细胞PIAS3/STAT3表达变化及肿瘤细胞增殖情况:免疫组化结果所示转染过表达PIAS3组瘤体组织中PIAS3在胞浆内呈阳性染色,而STAT3表达水平显著下降,尤其是核表达水平(P-STAT3)显著降低对应瘤块肿瘤细胞的增殖指数Ki67显著降低,与对照组具有显著统计学差异(P<0.05)。结论:1临床病例回顾性研究显示:PIAS3在胃癌组织中的表达水平与患者的肿瘤局部浸润及淋巴转移呈负相关。PIAS3在胃癌组织中的表达水平与胃癌患者的总体生存期呈正相关;提示PIAS3有望成为一个评价胃癌患者预后的潜在生物学标志物。2体外细胞学实验以及裸鼠移植瘤实验结果显示:PIAS3在胃癌组织细胞中表达下降,且与STAT3表达激活呈负相关关系,过表达PIAS3能够下调STAT3活性,并显著抑制胃癌细胞的增殖和转移,提示PIAS3通过抑制STAT3的表达介导胃癌细胞增殖转移,PIAS3是胃癌恶性进展的一种抑癌基因。