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背景:乳腺癌的发病率和死亡率居全球女性恶性肿瘤之首。近年来,虽然手术、放化疗、内分泌和靶向治疗在乳腺癌治疗中取得了较大进展,但是其死亡率仍居高不下。因此,探索新的治疗靶点、研发新兴靶向药物是乳腺癌个体化治疗的主要研究方向。细胞周期调控在乳腺癌的发生发展过程中起关键性作用,其调节失控是肿瘤产生和生长的重要机制之一。CDK4/6抑制剂是目前乳腺癌靶向治疗药物研究的最新热点,LY2835219是礼来公司研发的新兴CDK4/6抑制剂,该药物前期临床实验结果较好,尤其在ER阳性患者中药效明显,但是其用药后适应性反应和作用机制尚未完全明确;同时作为新一代靶向药物,CDK4/6抑制剂耐药领域研究尚属空白;此外,该药关系密切的细胞周期相关蛋白,如:Cyclin D1、ER、Skp2、p57等在乳腺癌标本中的表达仍需进一步探索。目的:利用乳腺癌细胞模型研究CDK4/6抑制剂LY2835219的适应性反应;构建耐药细胞株并探索耐药的原因和机制;探讨多种细胞周期相关分子在乳腺癌中的表达情况。方法:通过绘制细胞生长曲线、细胞周期实验,检测LY2835219处理后,细胞增殖能力和细胞周期变化情况;应用时效反应和剂量反应Western Blot检测LY2835219的最佳作用时间和作用剂量;同PD0332991药物对比,明确LY2835219药物效应。采用RT-PCR、Western Blot观察LY2835219处理后,细胞短时间内出现的适应性变化;应用荧光素酶报告基因实验,检测药物处理后ER活性的改变;采用免疫共沉淀测定Cyclin D1对ER的作用;联合使用LY2835219和氟维司琼(ICI182,780)后,检测细胞的增殖能力和CDK4/6-Cyclin D1-RB信号通路上蛋白水平变化。通过体外低浓度梯度递增联合大剂量间断冲击方法,建立对LY2835219稳定耐药的MCF-7、T47D细胞株MR和TR。通过生长曲线和细胞周期检测,观察MR、TR增殖能力和细胞周期变化;通过RT-PCR、Western Blot、FISH等多种方法,评价MR、TR内CDK4/6-Cyclin D1-RB信号通路上分子水平改变;使用CDK6下调慢病毒质粒感染MR、TR并建立CDK6稳定下调的耐药细胞,观察细胞对LY2835219效应变化;构建CDK6上调慢病毒质粒,感染T47D并建立稳定CDK6过表达细胞株,观察其对LY2835219敏感性的改变。采用免疫组化在乳腺癌组织和癌旁正常组织中,检测Cyclin D1、ER、PR、Skp2和p57蛋白的表达情况,进一步分析表达水平与临床病理因素及其预后的关系。结果:(1)细胞生长曲线和细胞周期实验显示,LY2835219可以抑制多种乳腺癌细胞生长并导致细胞周期G1/S期停滞,但在MDA468细胞中抑制作用不明显。时效反应和浓度反应Western Blot发现,LY2835219最佳作用时间为16 h~48 h,最佳作用浓度为100 nM~500 nM。与PD0332991对比,LY2835219所需抑制浓度更低。(2)RT-PCR、Western Blot、荧光素酶报告基因实验发现MCF-7在LY2835219短暂作用后产生Cyclin D1上升,ER活性上升等适应性反应。免疫共沉淀提示ER活性改变可能与Cyclin D1上升相关。氟维司琼(ICI182,780)和LY2835219联用后可以获得更好的细胞生长抑制效应,ER和Cylin D1适应性反应消失。(3)成功构建对LY2835219稳定耐药细胞株MR和TR。生长曲线和细胞周期实验证明耐药株对药物抵抗,可持续生长,无周期停滞。RT-PCR、Western Blot、FISH观察发现耐药细胞在mRNA、蛋白、DNA水平上均有CDK6的增加。在耐药株中敲低CDK6水平可恢复细胞对药物敏感性。在正常细胞中上调CDK6可以导致细胞对药物耐受性升高。(4)免疫组化结果显示Cyclin D1在乳腺癌中过表达,但其表达越高,肿瘤分化越好,TNM分期越早。Cyclin D1与ER表达正相关,且指示良好的临床预后。Skp2和p57在乳腺癌标本和细胞系中表达呈负相关,并都与乳腺癌预后相关,高Skp2/低p57预示着更差的预后。结论:(1)LY2835219通过调节细胞周期G1/S停滞抑制乳腺细胞生长,作用时间长,使用浓度低,是非常有效的CDK4/6抑制剂。(2)乳腺癌细胞在LY2835219短时间处理后,出现Cyclin D1升高、ER活性增强等适应性反应;LY2835219与氟维司琼联合后,适应性反应消失、生长抑制增强。(3)成功构建LY2835219稳定耐药细胞株。该细胞株中CDK6水平升高是LY2835219获得性耐药的主要原因。(4)Cyclin D1与ER在乳腺癌标本中正相关,指示较好临床预后;Skp2和p57表达呈负相关,高Skp2/低p57预示着更差的预后。二者结合可对乳腺癌的诊治及预后评估发挥重要作用。