论文部分内容阅读
研究目的、内容:IL-21/IL-21R信号途径在多种免疫细胞表达,能提高免疫细胞的抗原特异性反应,在机体抗肿瘤、抗感染以及自身免疫疾病中发挥重要的免疫功能,是促进固有免疫向适应性免疫转化的关键因素。目前研究报道,IL-21/IL-21R信号途径能够促进炎症细胞,如粒细胞、淋巴细胞、浆细胞等募集在感染部位,进而调节炎症免疫。沙眼衣原体小鼠肺炎菌株(Chlamydia muridarum,Cm)是严格的胞内寄生菌,具有独特的发育周期,通过呼吸道感染能引起宿主肺部炎症。目前对该病原体致病机制及宿主免疫防御机制的研究还不够深入,临床没有有效的衣原体疫苗用于疾病的预防和治疗。本研究拟探讨IL-21/IL-21R信号途径对沙眼衣原体呼吸道感染炎症应答的影响。首先明确Cm感染是否诱导IL-21的产生,其次探讨敲除IL-21R小鼠衣原体肺组织病理及单个核细胞浸润的变化。进一步探讨IL-21/IL-21R信号途径对肺组织单个核细胞中CD4~+T、CD8~+T、γδT、NK和中性粒细胞(PMN)浸润的影响及对PMN相关趋化因子MIP-2、KC、CXCR2和炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β表达的影响,从而明确IL-21/IL-21R信号途径在Cm呼吸道感染中对炎症细胞浸润的调节,为胞内菌感染疾病提供新的理论依据。研究方法:一定剂量的沙眼衣原体小鼠肺炎菌株(Chlamydia muridarum,Cm)经呼吸道感染C57BL/6小鼠(WT小鼠)诱导小鼠衣原体肺炎,待感染14天后,处死感染不同时间点的小鼠,提取小鼠肺组织总RNA,使用RT-PCR检测小鼠肺组织IL-21 mRNA的表达,明确C m感染是否诱导IL-21产生。用相同剂量的Cm经呼吸道感染WT小鼠及IL-21R基因敲除鼠(IL-21R-/-小鼠),获取不同感染时间点小鼠肺组织,分离制备单个核细胞悬液,利用台盼蓝染色计数肺组织单个核细胞;取WT小鼠和IL-21R-/-小鼠同一位置的肺组织,利用石蜡切片和HE染色技术进行肺组织病理染色,探讨肺组织炎症细胞浸润。使用荧光素标记的抗鼠CD3~+、CD4~+、CD8~+、γδ~+,NK1.1~+、CD11b~+、Gr1~+抗体染色肺组织单个核细胞,流式细胞仪检测CD3~+CD4~+T细胞,CD3~+CD8~+T细胞,CD3~+γδ~+T细胞,CD3-NK1.1~+NK细胞,CD11b~+Gr1~+PMN细胞在肺组织的浸润。使用RT-PCR技术检测PMN相关趋化因子MIP-2、KC、CXCR2和炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β的表达。研究结果:在沙眼衣原体小鼠肺炎菌株(Cm)经呼吸道感染诱导的小鼠衣原体肺炎中IL-21 mRNA的表达增高,于感染第3天开始增多,感染第7天达高峰,与未感染组比较有显著差异(P﹤0.001),之后逐渐降低,至感染第14天表达显著降低。使用一定剂量Cm同时感染WT小鼠和IL-21R-/-小鼠,随着感染天数的增加,两种小鼠肺组织单个核细胞总数均较未感染组显著增多,感染后第14天达到高峰;与WT小鼠比较,敲除IL-21R小鼠在感染的第3天、第7天和第14天肺组织单个核细胞总数有降低趋势,但两种小鼠间没有显著性差异。肺组织HE染色显示,敲除IL-21R小鼠在感染的第3天和第7天炎症反应较WT小鼠轻,但感染后期肺组织炎症恢复较慢,在感染的第14天肺组织病理仍较严重。我们使用Cm经呼吸道感染WT小鼠及IL-21R-/-小鼠,获取不同感染时间点小鼠肺组织单个核细胞,用荧光标记抗体进行染色,探讨IL-21对CD4~+T、CD8~+T、γδT、NK细胞及PMN在肺组织浸润的影响,结果显示与WT小鼠比较,敲除IL-21R小鼠肺组织CD4~+T细胞百分率及细胞总数在感染的第7天显著增高(P﹤0.001,P﹤0.05),CD8~+T细胞的百分率及细胞总数则显著降低(P﹤0.001),即IL-21/IL-21R信号途径能够抑制CD4~+T细胞同时促进CD8~+T细胞在感染肺组织的浸润;敲除IL-21R小鼠肺组织γδT细胞百分率及细胞总数在感染的不同时间点与WT小鼠比较没有显著差异;敲除IL-21R小鼠肺组织NK细胞百分率及细胞总数在感染的第7天显著降低(P﹤0.05,P﹤0.001),PMN细胞的百分率和细胞总数也显著降低(P﹤0.01),即IL-21/IL-21R信号途径能够促进NK细胞和PMN细胞在感染肺组织的浸润;RT-PCR检测与PMN相关趋化因子和炎症因子发现,与WT小鼠比较,敲除IL-21R小鼠肺组织MIP-2、IL-1β、TNF-α、IL-6、CXCR2 mRNA在感染的第7天表达显著降低(P﹤0.05,P﹤0.01,P﹤0.001),而在感染的第14天IL-21R-/-小鼠肺组织MIP-2、IL-1β、TNF-α、IL-6、KC mRNA表达显著增高(P﹤0.01,P﹤0.001),这与IL-21R-/-小鼠肺组织感染晚期阶段炎症恢复较慢结果一致。研究结论:1.Cm呼吸道感染诱导IL-21 mRNA在小鼠肺组织表达;2.Cm呼吸道感染中IL-21/IL-21R信号途径对CD8~+T、NK细胞在肺组织的浸润有显著的促进作用,对CD4~+T细胞在肺组织的浸润有显著的抑制作用,不影响γδT细胞在肺组织的增殖;3.Cm呼吸道感染IL-21/IL-21R信号途径促进肺组织中性粒细胞大量浸润,可能诱导PMN趋化性因子及炎症因子的表达实现,感染晚期阶段IL-21R-/-小鼠肺组织PMN趋化因子与炎症因子高表达与肺组织炎症恢复较慢密切相关。