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本研究将重组猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的S蛋白在E.coli中高效表达后,SDS-PAGE分析超声裂解细菌后的目的蛋白均在离心所得沉淀中。利用分步洗涤的方法提纯包涵体,采用切胶、电洗脱的方法纯化目的蛋白,再透析复性和浓缩洗脱液达到纯化回收蛋白的目的,此法获得的蛋白为免疫抗原。将提纯的包涵体用不同浓度的尿素和盐酸胍进行包涵体溶解条件的摸索,最后确定用8M尿素溶解包涵体蛋白。本试验采用分步透析复性法复性目的蛋白,并用镍离子金属螯合亲和层析法纯化目的蛋白,此法获得的蛋白为检测抗原。纯化蛋白经Western blotting检测能保持其原有的反应特异性。通过在PK-15细胞上增殖猪传染性胃肠炎病毒,浓缩纯化制备了全病毒检测抗原。以重组TGEV S蛋白为检测抗原时,最终确定ELISA的最佳工作条件为:包被抗原量为4μg/mL,包被液为CBS(pH9.6、0.05M),包被条件为4℃过夜,封闭物为1%明胶,封闭时间为1.5h,一抗稀释度为1:1600,酶标二抗最佳工作浓度为1:1000,底物作用时间为15min。以TGEV全病毒为检测抗原时,最终确定ELISA的最佳工作条件为:包被抗原量为1:400,包被液为CBS(pH9.6、0.05M),包被条件为37℃作用1h,4℃过夜,封闭物为1%明胶,封闭时间为1h,一抗稀释度为1:200,酶标二抗最佳工作浓度为1:1000,底物作用时间为15min。将纯化的重组TGEV S蛋白免疫Balb/c小鼠,按常规方法进行融合,用间接ELISA方法进行筛选,采用有限稀释法,经过3次克隆,最终获得3株抗重组TGEV S蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为1G6,2F8和3E5。3株杂交瘤细胞在体外长期培养和长期冻存复苏,抗体分泌能力有轻微下降,但仍能稳定地分泌抗体。间接ELISA检测3株细胞培养效价分别为1:3200、1:6400、1:6400,小鼠腹水效价分别为1:5×105、1:5×106、1:5×106。交叉试验结果显示,所制备的3株单抗与猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)均无交叉反应。Western blotting结果证实,3株单克隆抗体与重组TGEV S蛋白均能发生特异性结合。利用腹水单抗建立了检测TGEV S蛋白的单抗介导双夹心间接ELISA方法,将此法进行4次重复性试验,结果差异不显著,说明该双夹心间接ELISA方法具有良好的稳定性。所有的实验结果表明,所制备的抗重组TGEV S蛋白的单抗对病原检测具有很强的特异性,为TGE疫情监测和准确快速的病原诊断与鉴别诊断奠定了基础。