疯草是世界范围内危害草原畜牧业发展的最为严重的毒草之一，大量研究表明，苦马豆素是疯草的主要有毒成分。近年来，从疯草中分离到能产苦马豆素的Undifilum属内生真菌；疯草中苦马豆素含量与疯草感染Undifilum属内生真菌的数量具有很高的相关性；因此，部分研究人员把疯草感染Undifilum属内生真菌并产生苦马豆素看作是动物发生疯草中毒病的根本原因（Oldrup et al.,2010; Ralphs et al.,2008）。基于本实验室对我国主要疯草内生真菌的分离鉴定和遗传特征研究，本文主要对疯草内生真菌（FEL4-F5）菌液体培养基优化、内生真菌中的苦马豆素累积特性、内生真菌中苦马豆素的液相检测方法、内生真菌合成苦马豆素的前体物筛选、碳氮标记的赖氨酸的稳定性同位素示踪等方面进行了研究，为探讨内生真菌合成苦马豆素的生物途径、筛选高效生产苦马豆素的内生真菌奠定基础。1．疯草内生真菌FEL4-F5液体培养基的优化用Plackett-Burman试验对内生真菌FEL4-F5液体培养基组分、初始pH值、培养时间、培养温度等9个因素进行考察。结果发现蔗糖、K₂HPO₄、蛋白胨这3个因素对于内生真菌FEL4-F5的苦马豆素产量有显著影响。用响应面分析法Box-Behnken design试验最终优化出的疯草内生真菌液体培养条件为:培养基配方MgSO₄·7H₂O0.6g/L，KCl0.6g/L，FeSO₄0.02g/L，蔗糖15.58g/L，K₂HPO₄0.62g/L，蛋白胨0.34g/L，蒸馏水1000mL；培养时间28d、温度为18℃、pH值为7.5。该结果为后续研究疯草内生真菌合成苦马豆素合成途径的相关试验奠定了基础。2．疯草内生真菌FEL4-F5产苦马豆素累积特性的研究建立了改良酶分析法检测苦马豆素的方法，在0.05～0.5μg/mL的浓度范围内，苦马豆素浓度的负对数与其抑制的甘露糖苷酶的活性比值成线性关系。线性方程为：Y=0.5169X0.1129（R²=0.9972）。在所述的培养基和培养系统中，菌丝重量在第20天达到高峰，而菌丝中的苦马豆素含量在第28天时达到最大。结果表明，疯草内生真菌菌丝的生长和菌丝中苦马豆素的累积是不同步的。菌丝在生长至第24天时，进入苦马豆素快速合成期，第28天时菌丝中苦马豆素的合成量达到最大值。即内生真菌合成苦马豆素集中发生在其生长到第24～28天之间。这对于进一步探讨疯草内生真菌合成苦马豆素的途径有重要意义。3．疯草内生真菌中苦马豆素的HPLC-ELSD检测法建立根据苦马豆素的理化特性，对多种色谱柱、流动相进行了系统的筛选，对蒸发光检测器的运行参数进行优化，建立HPLC-ELSD检测内生真菌中苦马豆素含量的方法。色谱条件：Waters Xbridge HILIC色谱柱（150mm×4.6mm,3.5μm粒径），流动相乙腈∶乙酸铵（5mM/L）=1∶1（vol/vol）（另含0.02％氨水溶液），流动相流速0.5mL/min，进样量20μL。蒸发光检测器运行参数：气体流速25psi，漂移管温度55℃，增益值150。在15.625～250μg/mL的浓度范围内，苦马豆素浓度的对数与其对应峰面积的对数成线性关系，建立的线性方程为：Y=1.0641X+2.5679（R=0.9990）。苦马豆素的回收率在99.68～104.28％之间，R.S.D.在1.72～5.01％之间。因此，本试验所建立的色谱条件可以应用于液质联用仪，这为后续的研究疯草内生真菌合成苦马豆素合成途径的同位素示踪试验提供了技术保障。4．疯草内生真菌合成苦马豆素的前体物筛选试验在疯草内生真菌培养基中添加某些化合物，通过筛选试验发现添加L-组氨酸、脯氨酸、色氨酸、L-赖氨酸、哌可酸可对疯草内生真菌产苦马豆素的产量产生显著影响。结合已有的生源学说理论和苦马豆素生物合成途径的研究资料，认为L-赖氨酸和L-哌可酸很可能是疯草内生真菌合成苦马豆素的前体物质。5．碳氮标记赖氨酸的稳定性同位素示踪试验利用碳氮全标记的赖氨酸进行示踪试验，结果表明L-赖氨酸被标记的碳氮原子可以掺入到哌可酸和苦马豆素中，掺入率分别为88.74%和3.91%；推测在疯草的Undifilum属内生真菌中存在着一条由L-赖氨酸经哌可酸最终合成苦马豆素的合成途径。α位上的氮原子进行N¹⁵标记的L-赖氨酸(C₆¹²H₁₄N_α¹⁵N_ε¹⁵O₂)的示踪试验表明L-赖氨酸的α位上的氮原子能够转化到L-哌可酸中。即疯草的Undifilum属内生真菌能够通过P6C途径来实现由L-赖氨酸到L-哌可酸的转化。本研究为进一步研究合成苦马豆素详细的分子机制和动物疯草中毒病的防治提供理论依据。