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月季是世界范围内重要的观赏植物之一,被广泛用于切花和盆花生产以及庭院美化等。不同月季品种的株型差异很大,且受到一系列内源和外源因素的调控。miR156/SPLs作为植物中高度保守的调节模块参与了株型调控、幼年期控制等多种发育过程,但目前为止,其在月季生长发育过程中的作用机制还鲜见报道。本研究对miR156/RhSPL4在月季株型发育中的功能及其调控机制进行了初步解析,获得以下结果:1.在本实验室前期建立的月季small RNA数据库和降解组数据库中,筛选获得一个SBP-domain的转录因子RhSPL4,其在月季花瓣中受到miR156的剪切。利用RACE的方法获得RhSPL4的基因全长和miR156的前体基因序列。5’RLM-RACE证实miR156的靶位点位于RhSPL4基因的3’UTR。qRT-PCR表达检测显示,miR156的表达水平随叶片的生长发育持续升高,同时RhSPL4基因的表达水平也随叶片发育持续升高,呈现与miR156 一致的表达趋势;但RhSPL4同家族的成员RhSPL9和RhSPL13则呈现与miR156相反的表达趋势,表明月季SPLs家族不同成员可能存在不同的调节模式。2.以切花品种’Samantha’为材料,通过农杆菌介导的胚状体遗传转化法,获得了稳定过表达RhSPL4的转基因月季植株。与对照植株相比,Rh,SPL4稳定过表达月季植株中腋芽和侧枝数量显著增多。移栽后,转基因植株的直立性明显下降,侧枝增多,植株表现出多分枝的丛生表型。3.为解析RhSPL4导致株型变化的内在机制,通过RNA-seq分析了RhSPL4可能的下游基因。KEGG富集分析表明,RhSPL4过表达月季植株与对照植株相比,植物激素信号转导途径、昼夜节律途径和光合作用途径中相关的基因出现明显的表达差异。qRT-PCR检测确认了 RNA-seq的结果,同时发现rhy-MIR156的表达也被显著诱导,且RhSPL9/13的表达显著下降。在水稻中,RhSPL9和RhSPL13基因的同源基因IPA1和GW8均参与了水稻分蘖的调节,这两个基因的下调均可导致分蘖增多,暗示RhSPL4可能通过调节rhy-MIR156的表达,影响同家族的RhSPL9/13的表达,影响月季的株型发育。4.利用hiTAIL-PCR的方法,克隆得到1481 bp的rhy-MIR156启动子序列。元件分析表明,rhy-MIR156启动子序列上含有多个SBP转录因子识别的顺式作用元件。通过酵母单杂交,双荧光素酶和染色质免疫共沉淀的方法,证实RhSPL4蛋白能够直接靶定在rhy-MIR156的启动子上,并激活其表达。但是,RhSPL9和RhSPL13蛋白不能激活rhy-MIR156的表达。以上结果表明,miR156/SPLs在月季植株体内存在着复杂的反馈调节机制,且RhSPLs家族基因中的不同成员可能发挥着不同的作用。RhSPL4作为rhy-MIR156的上游基因,可以通过调控rhy-MIR156的表达来对同家族中的其他成员,如RhSPL9/13转录本的积累产生影响,从而调控月季植株形态。此外,RhSPL4基因还可能通过影响月季体内昼夜节律、生长素和赤霉素响应以及光合作用途径中相关基因的表达,进而在月季的株型发育中发挥重要的作用。