下咽鳞状细胞癌(hypopharyngeal squamous cell carcinoma,HSCC)在头颈部恶性肿瘤相对较为少见,但近年来发病率呈较快上升趋势,其总的发病率约占头颈部肿瘤的5%左右[1]。下咽癌早期的临床表现主要是咽部异物堵塞感、吞咽哽噎感,随着肿瘤瘤体的增大,尤其当表面发生溃疡及糜烂时,可引起吞咽不适伴有局部疼痛、同侧耳部可能出现反射性耳痛及痰中带血丝等不适,常伴有进行性的吞咽困难,当肿瘤累及喉腔时可出现声音嘶哑、发声及呼吸费力等症状。下咽癌最常见的发病部位位于梨状窝区(70%～80%),其次为下咽后壁区(5%～22%),环后区最为少见[2]。因下咽癌中95%以上为鳞状细胞癌,且大多数分化程度较差,易粘膜下浸润扩散,是头颈部恶性程度最高的肿瘤之一,且患者早期临床症状不明显,因此,在耳鼻喉头颈外科就诊时多数患者已是晚期(III期和IV期),肿瘤病变已扩散至舌根、喉腔和颈段食管等部位,而且常常伴有多处颈部淋巴结的转移,往往导致预后不良[3]。目前,HSCC治疗的目标是尽可能的根除肿瘤,减少手术的并发症,延长患者的生命,提高患者的生存质量。随着头颈部肿瘤诊段及治疗技术水平的不断提高,诸如放疗、化疗、手术或三种方法相结合的综合治疗等多种方案被应用于HSCC的临床治疗中[4,5,6]。其中,手术加放化疗的综合治疗方案是目前的主要治疗手段。虽然放化疗及手术技术等治疗手段都有了较大的发展,HSCC患者生存率较前有所改善,但由于HSCC患者就诊时多处于疾病较为晚期的阶段,且由于HSCC恶性程度较高,解剖位置深在,易于局部扩散和远处转移等特点,HSCC复发率仍较高,有研究[7]表明临床III期和IV期的HSCC患者5年生存率仅为25%-40%。因此,更加深入地研究HSCC的生物学特性,据此寻找肿瘤特异性的标志物,不断探求HSCC的早期诊断方法及更加高效的综合治疗方案成为目前头颈肿瘤外科亟待研究和解决的课题。ETS家族是目前所知最大的信号依赖的转录因子家族之一,目前所知,该家族共包含30多个成员,其通过调节细胞的增殖与分化、调节细胞凋亡[8,9,10]及上皮-间充质之间的相互作用,参与众多的生理和病理过程[11,12]。内皮细胞的增殖[13,14]、迁移、管腔形态的分化[15,16],将会导致肿瘤血管的生成[17,18]。近期的研究发现,ETS的家族成员ETS-1可参与肿瘤血管的生成,在肿瘤的发生发展及侵袭转移的过程中发挥了极为重要的作用[19,20]。ETS转录因子家族由原癌基因v-ETS编码,迄今为止已经发现了 30多个家族成员,包括:ETS-1、ETS-2、GABP α(GA-binding protein alpha)、Spi-1(salmonella pathogenicity island 1)等[21,22]。ETS2 为 E26 转录因子 2(E26 oncogene homolog 2),是众多的ETS转录因子家族成员之一,是细胞信号传导通路的效应产物,其可以调控众多的下游靶基因,通过调控各种信号通路或者调节各效应蛋白之间的相互作用,从而调节效应细胞的增殖、分化、凋亡以及血管的生成等[23,24]。ETS2在很多的组织和细胞中都有表达,研究发现,在不同的组织中ETS2的表达的量以及其功能也存在较大的差异,很多肿瘤中如肝癌[25]小细胞肺癌[26]、食管癌[27,28]、结肠癌[29,30]、乳腺癌[31,32]以及恶性血液肿瘤[33,34]等均可以发现ETS2基因的表达异常,推测ETS2的异常表达或易位会形成融合蛋白,可能与肿瘤的发生及进展关系密切,转录因子ETS2有可能成为肿瘤的潜在诊断的标志物,也有可能成为一个新的治疗靶点。因此,我们设计实验研究转录因子ETS2在HSCC的表达及发生发展中的作用机制,能够为HSCC的发生机制及生物治疗提供理论基础和实践指导,具有较大的理论及临床指导意义。目前尚未发现关于ETS2在HSCC组织及细胞中的表达及相关机制的研究报道。在本项课题研究中,我们分别从mRNA及蛋白水平检测了 ETS2在HSCC肿瘤组织和癌旁粘膜组织中的表达情况,并对患者进行定期规范的术后随访,详细记录相关的数据并分析探讨ETS2的表达与下咽鳞状细胞癌患者的年龄、性别、发病部位,肿瘤分级,颈部淋巴结转移情况,组织病理学分级,临床分期和预后之间的关系。利用小干扰RNA技术在人HSCC FaDu细胞系中敲掉ETS2,设计多项实验检测ETS2的低表达对人下咽鳞状细胞癌FaDu细胞周期、增殖、凋亡、侵袭与转移的影响,并探讨其可能的机制。第一部分ETS2在下咽鳞状细胞癌中的表达及其临床意义研究目的:研究ETS2在下咽鳞状细胞癌中的表达,并对ETS2的表达与患者临床病理特征以及预后之间的关系进行分析。实验方法:1.所有的组织学标本均来自山东大学齐鲁医院耳鼻咽喉头颈外科住院的患者,收集下咽鳞状细胞癌手术患者术后的肿瘤组织标本和距离肿块2cm以上的形态学正常的黏膜组织样本,并详细记录患者的临床病历资料。2.应用免疫组化染色的方法检测ETS2在癌组织及癌旁非肿瘤的黏膜组织标本中的表达。3.肿瘤组织和非肿瘤粘膜组织中的总RNA使用Trizol法来提取,利用Real-time PCR方法比较癌组织及癌旁非肿瘤的黏膜组织标本中ETS2在mRNA水平上的表达差异。4.从组织标本中提取总蛋白,应用蛋白质免疫印迹(Western Blot)的方法检测并比较癌组织及癌旁非肿瘤的黏膜组织标本中ETS2在蛋白水平上的表达差异。5.ETS2在HSCC癌组织及癌旁非肿瘤的黏膜组织样本中免疫组织化学染色阳性率的比较使用Pearson卡方检验分析;ETS2在癌组织及癌旁非肿瘤黏膜组织中mRNA的表达情况、蛋白质印迹分析蛋白定量结果的比较应用Wilcoxon秩和检验分析。ETS2相对表达量用平均值±标准差来表示,ETS2的表达与HSCC临床病理特征之间关系的分析采用卡方检验。应用Kaplan-Meier法绘制患者的生存曲线,差异分析应用log-rank检验。采用单因素的Cox回归分析ETS2的阳性表达及临床分期等因素对患者预后的影响,使用多因素Cox回归分析影响HSCC患者预后的独立危险因素。所有数据均使用GraphPad Prism 5.0软件和SPSS18.0统计分析软件进行统计学分析,所有统计学分析均为双侧,当p<0.05时被认为具有统计学意义。实验结果:1.共计58例下咽鳞状细胞癌手术患者入选此次研究,共收集到肿瘤标本58例,收集到癌旁非肿瘤的正常黏膜组织52例,其中梨状窝癌44例,环状软骨后区及下咽后壁区癌共计14例。T3和T4期患者共40例,占比69%,伴有淋巴结转移的患者有45例,占总患者数的77.6%,病理检查结果为高分化鳞癌16例,占27.6%,中等分化与低分化病例共42例,占72.4%,III-IV期的患者共有43例接近所选病例的3/4(74.1%)。所有入选的患者术后均经病理证实为鳞状细胞癌,所有患者标本的切缘均为阴性。2.免疫组化检查结果显示:ETS2在细胞核和细胞质中呈阳性表达,但主要表达在细胞核上,ETS2在81.0%(47/58)的癌组织中呈现阳性表达,在23.1%(12/52)的癌旁正常粘膜组织中表达阳性(p<0,001),统计结果表明:ETS2在下咽鳞状细胞癌肿瘤组织中的表达明显高于癌旁正常黏膜组织。3.Real-time PCR检查结果显示ETS2 mRNA在下咽癌肿瘤组织中的相对表达量(2.497 ± 0.163)较癌旁非肿瘤黏膜组织中(1.095 ± 0.058)明显增高,统计学分析表明,其差异具有统计学意义(p<0.001)。4.Western Blot结果显示:ETS2在下咽癌肿瘤组织中的相对的蛋白表达量为0.674±0.026,较癌旁非肿瘤的黏膜组织中相对的蛋白表达量(0.211 ±0.035)显著升高,经过统计分析,其差异具有统计学意义(P<0.001)。5.ETS2的阳性表达与原发肿瘤分级(p<0.001),同时与肿瘤的临床TNM分期(p<0.001)和组织病理学分级(p<0.001)以及颈部的区域淋巴结转移(p=0.005)有关,此外,ETS2的表达与患者肿瘤的原发部位、年龄和性别是不相关的。6.在所有纳入研究的患者之中,ETS2阳性表达的总体生存率显著低于ETS2阴性表达的患者(p<0.01),单因素的Cox回归分析,分析结果显示:原发肿瘤的大小及分级(p=0.0043),区域性的淋巴结转移情况(p=0.0012),肿瘤的临床TNM分期(p=0.0008),肿瘤标本的ETS2的阳性表达(p<0.001)均和患者的预后相关,多因素Cox比例风险回归分析中,肿瘤标本的ETS2的阳性表达是影响患者预后的独立的危险因素(p=0.003,HR 6.343,95%CI 2.211-15.786)。实验结论:ETS2在下咽鳞状细胞癌肿瘤组织中的表达显著增加,这种ETS2异常的表达与HSCC原发肿瘤的分级、区域性的淋巴结转移情况、组织病理学分级和肿瘤的临床TNM分期有关。ETS2的阳性表达与患者预后不良相关,此外,肿瘤标本的ETS2的阳性表达是影响患者预后的独立的危险因素,这些实验结果提示ETS2基因有可能成为治疗HSCC的新的靶向分子。第二部分基因敲除ETS2对下咽鳞状细胞癌FaDu细胞系的细胞周期、增殖、凋亡、侵袭与转移的影响及机制研究。研究目的:将ETS2-siRNA转染至人下咽鳞状细胞癌FaDu细胞系中,从而研究基因敲除ETS2对细胞周期、增殖、凋亡、侵袭与转移的影响及机制。实验方法:1.培养下咽癌细胞株FaDu细胞系,设计合成3组siRNA,siRNA-1,siRNA-2,siRNA-3,并设置 了阴性对照组 NC siRNA,采用的是 Lipofectamin 2000脂质体法进行转染。实验分三种浓度进行,分别为25nM,50nM,100nM依次进行,转染成功后,应用Real-time PCR及Western blot实验的方法检测siRNA的转染效率,从而筛选最适合的siRNA进行下一步实验。2.实验分为Control组、NC组、siRNA-ETS2组三组,应用CCK8和Brdu法,检测各组细胞的增殖情况,研究敲出ETS2后对HSCC FaDu细胞系细胞增殖的影响。3.应用流式细胞仪检测敲出ETS2后对HSCC FaDu细胞系细胞周期的影响。4.应用流式细胞仪和Hoechst染色检测三组细胞细胞凋亡的情况,研究敲除ETS2后对HSCC FaDu细胞系细胞凋亡的影响。5.应用Western Blot技术检测凋亡相关蛋白Bc12及Caspase3的表达情况,探讨敲出ETS2基因后对HSCC FaDu细胞系细胞凋亡的影响机制。6.应用Transwell侵袭实验及细胞划痕检测三组细胞的迁移侵袭能力,研究敲除ETS2基因后,FaDu细胞转移侵袭能力的变化。7.使用Western Blot技术的检测细胞中上皮标志物:E-cadherin,ZQ-1和间质标志物:Vimentin,α-SMA的表达,从而检测ETS2基因对FaDu细胞系上皮细胞-间充质转化(EMT)的影响。8.使用Western Blot技术检测MAPK信号通路中p38和p-p38,ERK和p-ERK,JNK和p-JNK相关蛋白的表达情况,探索ETS2对癌细胞MAPK信号通路的影响及影响细胞凋亡及迁移转移的途径。9.使用GraphPad Prism 5.0软件和SPSS18.0统计分析软件进行统计学分析,每个实验至少独立重复了 3次,所有的实验数据均按照平均值±标准差来表示,不同组别之间的差异用t检验或单因素方差分析来进行评估,所有统计学数据及分析均是P<0.05时,被认为具有统计学意义。实验结果:1.成功设计并合成了 3 组 siRNA,siRNA-1,siRNA-2,siRNA-3,并设置了阴性对照组NC siRNA,为了找寻最佳的实验浓度提高转染的效率,实验分三种浓度进行,分别为25nM,50nM,10OnM依次进行,采用Lipofectamin2000脂质体法进行转染,应用Real-time PCR的方法检测siRNA的转染效率,实验表明:最佳的转染浓度在1OOnM,在10OnM时NC-siRNA组、siRNA-1组,siRNA-2组,siRNA-3 组中 ETS2 的相对表达量分别为 1.000±0.046、0.561 ±0.034、0.334±0.023和0.156±0.016各组之间的差异具统计学意义(p<0.001),其中,siRNA-3瞬时转染效率可达80%左右。Western blot实验结果显示:经过siRNA-3转染下咽癌FaDu细胞系后,细胞的ETS2蛋白表达受到明显的抑制,ETS2蛋白在Control组、NC组、siRNA3转染组的相对表达量为1.012±0.031、0.992±0.022和0.213±0.015,差别具有统计学意义(p<0.001)。2.应用Brdu染色检测各组细胞增殖情况,结果显示:相较对照组而言,siRNA-ETS2组染色细胞数量明显减少,表明细胞的增殖活性受到明显的抑制;应用CCK8法检测各组细胞增殖情况,结果显示:分别与Control组和NC组相比较,敲除ETS2后在12h内FaDu细胞增殖未见明显差异,但在48h和72h后,FaDu细胞增殖受到明显的抑制(p<0.05)。实验表明:通过ETS2-siRNA转染FaDu细胞系造成ETS2的低表达,对FaDu细胞增殖活性产生了明显的抑制。3.应用流式细胞仪检测ETS2对FaDu细胞周期的影响,结果显示:Control组、NC组和siRNA-ETS2组细胞周期位于G0/G1期的比例依次为59.4%、57.2%、69。3%,细胞周期位于S期的比例依次为31.4%、33.4%、21%,细胞周期位于G2/M期的比例依次为9.2%、9.4%、9.7%,由此可见,行ETS2基因敲出的实验组siRNA-ETS2组相对于对照组,能够显著的诱导FaDu细胞聚集于G0/G1期,从而减少了 S期的细胞比率(p＜0.01)。4.使用Hoechst检测三组细胞凋亡,显微镜下发现细胞核呈蓝色团块状,凋亡发生后,可以发现蓝色团块及细胞核的碎裂,染色质因皱缩而发生的高亮。采用流式细胞仪检测了三组细胞凋亡率分别为:4.65%±0.53%、4.52%±0.48%和29.12%± 1.02%,siRNA-ETS2组细胞的凋亡率较对照组明显升高(p<0.01)。5.应用Western Blot技术检测凋亡相关蛋白Bc12/Caspase3的表达情况,结果显示:Control组,NC组和siRNA-ETS2组的Caspase3的相对表达量分别为1.012±0.033,1.098±0.064 和 2.859±0.102,三者相比,siRNA-ETS2 组的 Caspase3的相对表达量明显升高,差异有显著统计学意义(p<0.001);Control组,NC组和 siRNA-ETS2 组的 Bc12 的相对表达量为 1.119±0.029,1.090±0.018 和 0.549±0.013,三者相比,siRNA-ETS2组的Bc12的相对表达量明显降低,差异有统计学意义(p＜0.05)。6.应用Transwell侵袭实验检测敲除ETS2基因后,FaDu细胞转移侵袭能力的变化,镜下观察transwell下室中细胞迁移及侵袭情况并计数,统计学分析表明:与Control组、NC组相比较,siRNA-ETS2组细胞的侵袭及迁移数量明显减少(p<0.01);细胞划痕实验显示:被敲掉ETS2基因后的FaDu细胞48h后的细胞迁移距离小于Control组和NC组,两者之间的差异具有统计学意义(p<0.01),实验表明:当FaDu细胞被敲掉ETS2基因后,显著减弱了细胞的侵袭和转移能力。7.使用Western Blot技术的检测细胞中上皮标志物,结果表明:Control组,NC组和siRNA-ETS2组的上皮标志物E-cadherin的相对表达量分别为1.097±0.043,0.986 ±0.023和3.879±0.124,三组的上皮标志物ZQ-1的相对表达量分别为 1.055±0.075,0.093±0.056 和 4.198±0.176,siRNA-ETS2 组和对照组相比,E-cadherin和ZQ-1的相对表达量明显上调,差异有显著统计学意义(p<0.001)。三组之间的间质标志物Vimentin的相对表达量为1.118±0.033,1.123±0.081和0.335±0.022,α-SMA 的相对表达量为 1.012±0.021,1.114±0.062 和 0.298士0.014,siRNA-ETS2组和对照组相比,其Vimentin及α-SMA的表达明显下调,其差异有统计学意义(p<0.01)。分析表明:抑制了 ETS2的表达后,肿瘤细胞通过增加E-cadherin,ZQ-1的表达和减少Vimentin和α-SMA的表达从而抑制了细胞间充质转化的进程。8.使用Western Blot技术检测MAPK信号通路中p38和p-p38,ERK和p-ERK,JNK和p-ERK相关蛋白的表达情况,结果表明:当TGF-β诱导的细胞激活后,细胞中p-p38,p-ERK和p-ERK蛋白的相对表达量较对照组明显升高,差异具有统计学意义(p<0.01),但TGF-β +siRNA组的p-p38,p-ERK和p-ERK蛋白和TGF-β组,TGF-β+NC组相比较而言,其升高程度受限,差异明显(p<0.01),研究证实:ETS2被敲除后,会导致MAPK/p38/ERK/JNK的信号通路受到抑制,表明在TGF-β诱导的肿瘤的上皮细胞-间充质转化(EMT)过程中,ETS2通过MAPK信号通路发挥了重要作用。实验结论:通过ETS2-siRNA转染人下咽鳞状细胞癌FaDu细胞系从而敲除ETS2后,与对照组相比可诱导FaDu细胞聚集于G0/G1期,显著抑制细胞的增殖,并促进了 FaDu细胞的凋亡;通过抑制了 MAPK/p38/ERK/JNK的信号通路,抑制了细胞间充质转化的进程,从而减弱了细胞的侵袭和转移能力。