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目的以三叶草斑潜蝇（Liriomyza trifolii）为抗原,制备单克隆抗体（Monoclonal antibody,简称单抗）,利用生物学技术研究单抗的特性,优化间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测实验条件,建立一套完整的间接ELISA检测方法鉴定三叶草斑潜蝇。通过比较DNA条形码鉴定法和ELISA检测方法的优缺点,明确ELISA检测方法的优势。采集2012年4月-11月份杭州市区及周边县市田间蔬菜样本,利用基于三叶草斑潜蝇单抗建立的间接ELISA检测方法实现对田间三叶草斑潜蝇种群发生动态的监测,为三叶草斑潜蝇的防治提供实验依据。方法①应用杂交瘤技术,以三叶草斑潜蝇蛹作为抗原,制备针对三叶草斑潜蝇的单抗。②采用Western blot、间接ELISA等生物学技术,研究三叶草斑潜蝇单抗的结合蛋白、效价、特异性、灵敏度、最佳工作浓度、亚类等特性。③以三叶草斑潜蝇蛹做为抗原,豌豆彩潜蝇做为阴性对照,倍比稀释,确定三叶草斑潜蝇幼虫、蛹、成虫样品检测的最佳稀释倍数。④提取了三叶草斑潜蝇基因组DNA,以细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COI）及内转录第一间隔区（ITS1）序列做为DNA条形码,通过PCR扩增了三叶草斑潜蝇COI和ITS1序列的部分片段,经测序、拼接后,与Genbank中三叶草斑潜蝇、美洲斑潜蝇（Liriomyza sativae）、南美斑潜蝇（Liriomyza huidobrenisis）、豌豆彩潜蝇（Chromatomyia horticola）的COI及ITS1序列进行比对,并进行遗传分析。同时比较DNA条形码鉴定法与间接ELISA检测法鉴定三叶草斑潜蝇的优缺点。⑤采集2012年4月～11月杭州市余杭区、滨江区、西湖区及富阳市等地青菜、芹菜、豇豆、四季豆、莴苣、蒿菜和芥菜等蔬菜作物叶片上的潜叶蝇样本,利用已建立的间接ELISA检测方法鉴定,监测各地田间三叶草斑潜蝇的发生量在潜叶蝇中的比例,从而为三叶草斑潜蝇的发生规律研究和防治提供实验依据。结果①应用杂交瘤技术,筛选获得了一株能够稳定分泌三叶草斑潜蝇单抗的杂交瘤细胞株4C9F2。制备并获得腹水型单抗100mL。②采用间接ELISA方法检测三叶草斑潜蝇单抗与南美斑潜蝇幼虫、蛹、成虫在490nm波长的OD值分别为0.267、0.233和0.271,与豌豆彩潜蝇幼虫、蛹和成虫在490nm处的OD值分别为0.221、0.204、0.229。与三叶草斑潜蝇幼虫、蛹和成虫抗原在490nm处的OD值为0.760、0.880、0.698。腹水型单抗的效价为8.192×106。该抗体的检测灵敏度为45.3μ/L。腹水型单抗稀释2×104倍间接ELISA检测的OD值为1.021。4C9F2单抗亚类为IgA。Western blot表明,该单抗能与三叶草斑潜蝇的分子量约为122kDa和68kDa的蛋白条带结合。③田间采集的单头潜叶蝇蛹、幼虫和成虫样品分别用16mL、1mL和500μL包被液研磨后取100μL用于间接ELISA检测,所得检测OD值分别为0.933、1.129、1.047。④COI和ITS1DNA片段作为条形码均可以将三叶草斑潜蝇同其它3种近缘种区分开。对于COI序列,三叶草斑潜蝇与南美斑潜蝇相似度为68%,亲缘关系最近；对于ITS1序列,三叶草斑潜蝇与美洲斑潜蝇相似度为88.5%,亲缘关系最近。⑤田间样品的检测表明,在2010年9月-11月份之间,余杭区、滨江区、西湖区、富阳市等四个区市采集的样品阳性率均在70%-80%之间。在青菜、芹菜、豇豆、四季豆、莴苣和蒿菜等蔬菜作物上采集的潜叶蝇样品的阳性反应率均在50%以上,但不同农作物间的阳性率差异显著,在芹菜上的阳性反应率最高,达到92.4%。结论①应用杂交瘤技术,筛选获得了一株能够稳定分泌三叶草斑潜蝇单抗的杂交瘤细胞株4C9F2。②该细胞株分泌的单抗效价高、特异性强、灵敏度高。在此基础上建立了田间采集的单头潜叶蝇蛹、幼虫和成虫样品分别用16mL、1mL和500μL包被液研磨后取1001μL包被酶标板,单抗稀释20000倍,酶标二抗稀释4000倍的间接ELISA方法用于鉴定田间采集的潜叶蝇是否为三叶草斑潜蝇。③COI和ITS1DNA序列作为DNA条形码和基于单抗的间接ELISA方法均可用于三叶草斑潜蝇的鉴定。但相对而言,DNA条形码鉴定更适于实验室的科学研究。间接ELISA整个过程只需加样操作,技术难度低,适于大量检测田间样本,为实现对外来入侵物种三叶草斑潜蝇的动态检测提供了很好的方法。④在近缘种中,杭州市余杭区、滨江区、西湖区及富阳市的三叶草斑潜蝇多发于9月～11月份。青菜、芹菜、豇豆、四季豆、莴苣和蒿菜均为三叶草斑潜蝇的寄主植物,其中三叶草斑潜蝇偏好于取食芹菜。