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【目的】观察嘌呤能P2X7/P2X4受体对大鼠缺氧缺糖损伤海马脑片中IL-1α、IL-1β及IL-18合成和释放的调节作用。
【方法】雄性SD大鼠体重150-200g,断颈处死后分离海马,0℃制备400μm海马脑片,随后应用95%O2/5%C02饱和的aCSF于35℃恒温孵育30min使其恢复活性。脑片随机分为四组:1)空白对照组(C组),继续应用95%O2/5%CO2饱和aCSF孵育不同时间;2)OGD组(0组),将孵育后的脑片移至95%N2/5%C02饱和的无糖aCSF中,并置于持续充以95%N2/5%CO2(0.6ml/min)的容器内进行缺氧缺糖处理(oxygen/glucose deprivationOGD);3)OGD+BBG.组(OB组),将孵育后的脑片移至加入P2X7受体特异性拮抗剂BBG(终浓度luM)的95%02/5%C02饱和的aCSF中孵育20分钟,再进行同O组相同的缺氧缺糖处理(无糖aCSF中加入相同浓度的BBG);4)OGD+anti-P2X4组(OP组),将孵育后的脑片移至加入P2X4受体抗体(终浓度1.5ug/ml)的95%O2/5%C02饱和的aCSF中孵育60分钟,再进行同0组相同的缺氧缺糖处理(无糖aCSF中加入相同浓度的P2X4受体的抗体)。各组在缺氧前和缺氧后20min、40min和60min检测脑片孵育液中的乳酸脱氢酶(LDH)、IL-1α、IL-1β及IL-18的含量,HE染色观察脑片组织病理形态学变化和Western blot检测脑片细胞内IL-1β及IL-18前体蛋白含量。所有计量资料以均值±标准差((-x)±s)表示,组内不同时点间的比较应用双因素方差分析,组间同一时点的比较采用单因素方差分析和LSD检验,P<0.05表示差异有统计学意义。
【结果】与OGD前比较,0、OB、OP组缺氧缺糖后各时点所有指标均有显著性增高(P<0.05)。1)O组LDH释放量同C组比较显著增高(P<0.05),且随缺氧缺糖时间延长而进行性升高;OB组缺氧缺糖40min和60min时点LDH释放量较O组显著降低(P<0.05),而OP组缺氧缺糖各时点LDH释放量与O组无统计学差异。2)HE染色显示,BBG可减轻脑组织损伤,而P2X4抗体无影响。3)与缺氧缺糖前相比,IL-1a和IL-1β在0组的释放显著升高(P<0.05),OGD后20min达到高峰并维持在高水平;而IL-18在缺氧缺糖后释放逐渐升高,与OGD前比较有统计学差异(P<0.05),在OGD后60min释放达到高峰,明显高于OGD后20min和40min(P<0.05)。与C组相比,IL-1a、IL-1β和IL-18在O组各时间点的释放均显著升高(P<0.05);与O组相比,OB组IL-1a和IL-1β释放明显减少(P<0.05),但IL-18无明显变化,OP组的上述指标与O组也无明显差异。4)各组在缺氧缺糖后细胞内IL-1β前体蛋白和IL-18前体蛋白都明显积聚,与C组比有统计学差异(P<0.05)。与O组相比,OB组IL-1β前体蛋白积聚进一步增加(P<0.05)但IL-18无明显变化。OP组的IL-1β前体蛋白和IL-18前体蛋白与O组比较无明显差异。
【结论】炎性介质IL-1的合成和释放在缺血缺氧引起的脑组织损伤病理过程中起到重要的增恶作用,P2X7受体调节了脑缺血时IL-1a和IL-1β的合成和释放而对IL-18的合成和释放无调节作用。这些结果表明在脑缺血损伤中,抑制或拮抗P2X7受体可能是脑缺血损伤治疗的一个潜在性的药物干预靶点。