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第一部分:GLP-1对AGEs诱导H9C2心肌细胞凋亡的影响及机制研究第一节:AGEs诱导H9C2心肌细胞损伤模型构建目的:体外培养H9C2心肌细胞,运用晚期糖基化终末产物（Advanced Glycation End Products,AGEs）诱导H9C2心肌细胞损伤,构建AGEs心肌细胞损伤模型,为研究胰高血糖素样肽-1(Glucogon like pep tide-1,GLP-1)对AGEs诱导H9C2心肌细胞损伤的影响及机制提供平台。方法:待H9C2心肌细胞融合85%左右,分别加入1mg·L-1 BSA（Control组）,不同浓度AGEs-BSA(50、100、200mg·L-1),经处理24h后;在倒置荧光显微镜下观察细胞形态学变化,并分别运用LDH Cytotoxicity Assay Kit、Cell Counting Kit-8（CCK8）比色法及Hoechst33258核染色法,分别检测细胞乳酸脱氢酶（LDH）含量、细胞生存率及细胞凋亡率,观察不同浓度的AGEs-BSA对H9C2心肌细胞的影响。结果:1)与Control组相比,AGEs-BSA呈浓度依赖性地导致H9C2心肌细胞损伤。主要表现为:随着AGEs-BSA浓度升高,细胞生存率、细胞凋亡率逐步降低,细胞中LDH含量呈现递增,心肌细胞形态学显现逐渐加重的损伤趋势。2)100mg·L-1AGEs-BSA与200 mg·L-1AGEs-BSA组间细胞凋亡率无显著差异（P>0.05）。结论:1)AGEs-BSA呈浓度依赖性的诱导H9C2心肌细胞损伤。2)100mg·L-1AGEs-BSA可作为AGEs诱导细胞损伤的实验剂量浓度。第二节:GLP-1对AGEs诱导H9C2心肌细胞凋亡的保护作用及机制研究目的:探讨胰高血糖素样肽素-1(Glucogon like pep tide-1,GLP-1)对AGEs诱导H9C2心肌细胞凋亡的保护作用及相关机制。方法:体外培养H9C2细胞,随机分组为:Control组:1mg·L-1 BSA、AGEs组、AGEs+5nmol·L-1 GLP-1组、AGEs+10nmol·L-1GLP-1组、AGEs+20nmol·L-1GLP-1组,其中,AGEs为100mg·L-1AGEs-BSA。经处理、培养24h后,通过荧光倒置显微镜观察细胞形态,LDH Cytotoxicity Assay Kit检测乳酸脱氢酶（LDH）活性,CCK-8比色法检测细胞存活率,Hoechst33258试剂盒及Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒检测心肌细胞凋亡率,RT-PCR法测定Bax、Bcl-2基因m RNA表达,Western Blot蛋白印迹法检测相关蛋白Bax、Bcl-2的表达。结果:1)与Control组相比,AGEs组可显著降低H9C2细胞生存率（P<0.01）,增加细胞中LDH含量及细胞凋亡率（P<0.05）。2)与AGEs组相比,经10nmol·L-1、20nmol·L-1GLP-1干预后,细胞生成率均显著提高（P<0.05）,细胞内乳酸脱氢酶（LDH）含量及细胞凋亡率均明显减少（P<0.05）。3)与Control组相比,100mg·L-1AGEs可致促凋亡蛋白Bax的m RNA及蛋白表达明显增加、抑凋亡蛋白Bcl-2的m RNA及蛋白表达显著减少（P<0.05）;而经10nmol·L-1 GL-P-1干预后,上述两项指标均出现逆转变化。结论:1)GLP-1对AGEs诱导的H9C2心肌细胞损伤具有保护作用。2)GLP-1可显著抑制AGEs诱导的H9C2心肌细胞凋亡,其机制与调节Bax/Bcl-2有关。第二部分:GLP-1对AGEs诱导H9C2心肌细胞自噬的影响及机制研究第一节:AGEs对H9C2心肌细胞自噬的影响目的:探讨不同浓度AGEs对H9C2心肌细胞自噬（Autophagy）的影响。方法:在H9C2心肌细胞融合85%左右,随机分组,Control:1mg·L-1 BSA,不同浓度AGEs-BSA(50、100、200mg·L-1);经培养24h后,运用Western Blotting分别检测不同浓度的AGEs对心肌细胞LC3B、Beclin1蛋白表达的影响。结果:1)LC3B、Beclin1蛋白随着AGEs浓度升高而呈增强表达趋势。2)与Control组相比,100mg·L-1、200mg·L-1 AGEs组的LC3B、Beclin1蛋白表达均分别具有统计学差异（P<0.05）。3)在100mg·L-1AGEs组与200mg·L-1 AGEs组间,LC3B、Beclin1蛋白表达差异没有统计学意义（P>0.05）。结论:1)AGEs呈浓度依赖性地激活H9C2心肌细胞自噬。2)100mg·L-1 AGEs可作为自噬激活浓度。第二节:GLP-1抑制AGEs诱导的H9C2心肌细胞自噬及机制研究目的:观察GLP-1对AGEs诱导H9C2心肌细胞自噬的影响,初步探讨GLP-1心肌细胞保护作用与自噬活性关系。方法:体外培养H9C2细胞,随机分组:1)Control组:加入1mg·L-1BSA;2)AGEs组:加入100mg·L-1AGEs;3)AGEs+GLP-1组:同时加入100mg·L-1AGEs和10nmol·L-1 GLP-1;4)AGEs+GLP-1+Rapamycin组:同时加入100mg·L-1AGEs、10nmol·L-1 GLP-1及5μmol·L-1 Rapamycin（自噬诱导剂）。各组在经上述处理24h后,分别用CCK-8法检测细胞存活率,DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧（ROS）水平,流式细胞仪检测细胞自噬溶酶体形成,RT-PCR检测LC3、Beclin1基因的m RNA水平,Western blot法检测自噬相关蛋白(LC3B,Beclin-1)表达,Ad-m Cherry-GFP-LC3B方法检测细胞自噬流。结果:1)与Control组相比,AGEs组细胞生存率明显减少（P<0.01）,细胞内ROS水平显著增高（P<0.01）,细胞自噬溶酶体水平、LC3B、Beclin1基因m RNA及蛋白表达均明显增加（P<0.05）;2)与AGEs组相比,AGEs+GLP-1组细胞生存率显著增高（P<0.05）,细胞内ROS水平,细胞自噬溶酶体水平,LC3B、Beclin1基因m RNA表达及蛋白表达均明显下降（P<0.05）;3)与AGEs组相比,AGEs+GLP-1+rapamycin组中细胞内ROS水平降低（P<0.05）,而细胞生存率,细胞自噬溶酶体水平,LC3B、Beclin1基因m RNA表达及蛋白表达未见显著差异（P>0.05）。结论:1)AGEs可引起H9C2心肌细胞内活性氧（ROS）升高,导致细胞损伤并激活细胞自噬。2)GLP-1对AGEs诱导的H9C2心肌细胞损伤具有保护作用,其保护机制可能与细胞自噬活性抑制有关。