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热应激蛋白72(heat shock protein，HSP72)是一种主要在应激状态下诱导产生的蛋白，属于HSP70家族成员。在体内其主要功能是帮助细胞内新生蛋白的装配、折叠和转运，促进变性蛋白的复性和降解，维持细胞内的蛋白平衡，从而有助于细胞在应激环境下生存。大量的研究表明HSP72在许多炎症疾病中起着缓解炎症症状的作用，而近年来的研究发现在动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)慢性炎症疾病病人尸检材料中检测到了HSP72的高表达，其存在的部位主要是坏死区域外周的巨噬细胞中，对于AS疾病中HSP72的存在仅是作为应激的标志物或是起某种调节作用的研究引起了人们极大的兴趣。oxLDL和LPS是导致动脉粥样硬化发生的重要致炎因子，本实验以RAW264.7细胞为模型，观察HSP72对脂多糖和oxLDL刺激作用下炎性因子表达的调节及调节机制研究，从而从炎症发生的角度探讨HSP72在AS疾病中的作用。 全文共分三部分 第一部分 热应激处理细胞HSP72表达特征及其对炎性刺激的影响 所有的生物当其接触外界的应激后，将迅速启动高度程序化的反应——热休克反应(heat shock response)，其中细胞内HSP72的诱导表达是热休克反应的特征事件，为了研究细胞内诱导产生的HSP72作用，本实验以43℃热激处理小鼠RAW264.7细胞，分别通过Western blot及免疫组化实验观察细胞内HSP72含量、分布的变化;以及热休克处理前后细胞内IkBα(NF-kB抑制蛋白)含量的变化;通过RT-PCR检测了热应激处理前后RAW264.7细胞经LPS刺激后胞内COX-2表达的变化;结果显示:正常RAW264.7细胞中内源性HSP72表达极微，热激处理后细胞内HSP72含量明显增加，而且应激后不同的恢复时间，HSP72表达量发生变化，呈现先上升，12小时到达峰值后再下降的趋势。静息状态下，HSP72主要存在于胞浆，免疫荧光结果显示细胞在热激处理后胞核内HSP72增加。Western blot和免疫组化结果显示热激处理后细胞内IkBα(NF-kB抑制蛋白)含量增加。细胞与LPS孵育4小时后胞内COX-2 mRNA比未刺激组增加约4倍左右，而热激处理组胞内COX-2 mRNA增加约1倍左右。两组相比，P值小于0.05，差异有显著意义。上述结果表明:RAW264.7细胞中无组成型表达的HSP72，但细胞在受热激处理后胞内HSP72表达增加，并且对LPS刺激产生炎症反应的能力降低，为了研究HSP72是否是热激处理后细胞减缓炎症作用的效应分子，本课题进行了进一步证明。 第二部分 巨噬细胞内HSP72过度表达对LPS刺激的炎性介质表达影响及机制 LPS是一种促进AS的致炎分子，为了确定HSP72蛋白在LPS刺激下的调节作用，本实验首先构建pCD-hsp72真核表达载体，然后采用基因转染的方法转染小鼠巨噬细胞RAW264.7，G418筛选获得高表达HSP72蛋白的细胞。再分别用LPS刺激未转染和转染的巨噬细胞，RT-PCR和Western blot方法检测两组细胞内炎性因子COX-2表达的变化;同时采用免疫荧光、Western blot方法检测不同细胞中IkBα含量的变化。结果显示:转染组细胞中HSP72的表达明显高于对照组，LPS刺激RAW264.7细胞后，导致胞内COX-2表达增加，而IkBα含量则降低。刺激转染细胞后发现，胞内COX-2 mRNA和蛋白增加量明显低于未转染细胞，而IkBα含量则高于未转染组细胞，两组间相比p＜0.05，差异具有显著意义。上述结果表明:细胞内HSP72能抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中COX-2表达的上调，而且此作用可能通过抑制LPS诱导的NF-κB的活化来实现。 第三部分 巨噬细胞内HSP72过度表达对oxLDL刺激的炎性作用及脂质摄取的影响 oxLDL是重要的致AS因子，其机制之一就是oxLDL可作为致炎分子激活胞内的信号通路引起炎性反应。为了探讨细胞内的HSP72蛋白是否能调节oxLDL引起的炎性反应，本实验采用RT-PCR、Western blot方法检测了oxLDL刺激条件下未转染和转染巨噬细胞内炎性介质COX-2表达的变化;同时用Western blot方法检测两种细胞在oxLDL刺激后胞浆中IkBα含量的变化和胞核中NF-kB含量的变化;通过油红O染色观察oxLDL诱导的未转染和转染巨噬细胞泡沫化程度并测定了细胞内堆积脂质的含量和种类。结果显示:oxLDL刺激RAW264.7能导致细胞内COX-2mRNA和蛋白水平含量增加，而oxLDL孵育转染细胞则发现胞内COX-2mRNA和蛋白水平与未转染组相比明显降低，通过对oxLDL刺激的两种细胞胞核中NF-kB含量及胞浆内IkBα含量的比较发现:oxLDL刺激导致胞核中，NF-kB含量增加，而转染细胞则抑制此作用。比较未转染细胞与转染细胞胞浆中IkBα含量发现无显著差异。油红O染色观察结果表明oxLDL能导致RAW264.7细胞和转染细胞泡沫化发生。而且脂质含量测定结果无明显差异。以上结果表明:细胞内HSP72能抑制oxLDL诱导的RAW264.7细胞中COX-2表达的上调，而此作用可能是不依赖于IKK/NF-kB信号通路;HSP72的表达对于oxLDL导致巨噬细胞脂质堆积无明显调节作用。