论文部分内容阅读
病毒入侵宿主细胞后,天然免疫系统随即被激活,进而启动抗病毒免疫应答反应。2’-5’-寡聚腺苷酸合成酶(2’-5’-O1igoadenylate synthetase,OAS)家族蛋白以其能够激活RNase L介导的病毒RNA降解通路,在天然免疫中发挥着重要的作用。在后生动物中,OAS基因可以分为OAS1、OAS2、OAS3和OASL四个超家族,OASL(OAS-like)基因作为OAS家族的非典型成员(OASL蛋白C端包含两个串联的UBL结构域),在哺乳动物中存在OAS酶活性的差异,而OAS酶活性的差异导致哺乳动物OASL蛋白在激活OAS/RNase L和OASL/RIG-I通路发挥抗病毒活性的差异。与哺乳类相比,大多数鸟类(如鸡和鸭等突胸目)OAS基因家族成员单一,只存在OASL一个成员;在平胸目鸟类(如鸵鸟和白喉(?)中,除具有OASL外,OAS1基因也被保留了下来。目前,关于鸟类OASL基因功能研究鲜有报道。首先对不同鸟类(鸭和鸵鸟)OASL蛋白的抗病毒活性进行分析,结果发现无论是高致病性(A/duck/Hubei/49/05)还是低致病性(A/goose/Hubei/65/05)H5N1禽流感病毒在稳定过表达鸭OASL的DF1细胞中的复制都显著降低(P<0.05),鸭OASL对这两株流感病毒的抑制作用与鸭RIG-Ⅰ相当;进一步利用CRISPR/Cas9技术获得OASL敲除的DF1细胞系(DF1OASL-/-),结果发现鸭和鸵鸟OASL(dOASL和oOASL)都能显著抑制另外一株H5N1禽流感病毒(A/chicken/huabei/0513/2007)在细胞中的增殖,并且该毒株在DF1OASL-/-细胞中的复制显著增加(P<0.05);此外,鸭和鸵鸟OASL都能显著抑制另外一株单股负链RNA病毒(NDV/LaSota)和两株双链RNA病毒(IBDV/B87和REOV/Z97/C10)在细胞中的增殖,并且这些病毒在DF1OASL-/-细胞中的复制显著增加(P<0.05);鸭OASL还能够抑制单股正链RNA病毒(O/BY/CHA/2010)在IBRS2细胞中的增殖(P<0.05);然而,无论是鸭还是鸵鸟OASL对两株DNA病毒(FPV/CVCC/AV1003和PRV/Henan/2014)在细胞中的复制都没有显著影响。以上研究表明,鸟类OASL能够广泛抑制多种RNA病毒的增殖,对DNA病毒的复制没有显著影响,这与某些哺乳类OASLs的抗病毒活性相似。接下来,对鸭和鸵鸟OASL蛋白的OAS酶活性进行检测,结果发现与小鼠Oasl2(mOas12)相似,鸭和鸵鸟OASL都具有OAS酶活性,并且能有效激活RNase L;进一步研究发现,鸟类和哺乳类OASL蛋白(dOASL、oOASL、hOASL和mOasl2)利用其自身3个天冬氨酸(同源于人OAS1蛋白Asp75-Asp77-Asp148)的突变可逆的开启或关闭RNase L通路;同时具有OAS 酶活性的OASL蛋白能够显著上调RNaseL和多个干扰素通路相关基因(如IFNα、IFNβ、STAT1和MX1等)的表达(P<0.05);对OASL蛋白不同结构域截短体的研究发现,鸟类和哺乳类OASL激活RNase L通路具有UBL结构域的依赖性差异,与哺乳类不同,鸟类OASL蛋白发挥有效的OAS酶活性依赖其UBL结构域对dsRNA的结合作用,从而协同其OLD结构域激活并放大RNase L通路发挥抗病毒活性。本研究还发现,失去OAS酶活性的鸭和鸵鸟OASL-3D*突变体能够放大RIG-I信号,这与人OASL和小鼠Oasl2-3D*的研究相一致;相比较而言,同样失去OAS酶活性的鸭OASL-3K*和人OASL-R*K*K*突变体对RIG-I信号都没有放大作用,因此OAS酶活性失活是鸟类和哺乳类OASL蛋白放大RIG-I信号的必要不充分条件;另外,与人和小鼠相似,鸭OASL与鸭RIG-I蛋白存在互作,并且它们之间的相互作用不受自身3个天冬氨酸(同源于人OAS1蛋白Asp75-Asp77-Asp148)突变的影响,也不依赖于病毒的诱导,OLD结构域为OASL和RIG-Ⅰ互作的核心结构域;无论是鸟类还是哺乳类OASL对RIG-Ⅰ信号的放大作用都依赖其完整的UBL结构域。此外,与小鼠Oasl1不同,鸭OASL蛋白与鸭IRF7基因的5’UTR区不存在结合作用;同时鸟类可能不存在MBD1基因,因此鸟类不存在与人相似的OASL-MBD1直接互作机制。综上所述,本研究阐明了由鸟类和哺乳类OASL蛋白介导调控的OAS/RNase L和OASL/RIG-Ⅰ通路的分子交流机制。这些结果为鸟类和哺乳类OASL基因在流感等RNA病毒抗病中的深入研究提供理论依据。