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本研究以大鼠离体心脏和人源心肌细胞为研究对象,观察邻苯二甲酸单乙基己基酯(MEHP)对心肌细胞的损伤作用,并进一步探究氧化应激和转录因子FOXO3a在MEHP所致心肌细胞损伤中的作用。第一部分:MEHP对心肌的损伤作用及氧化应激在其中的作用研究目的:以大鼠离体心脏和人源心肌细胞为研究对象,观察MEHP对心肌细胞的损伤作用,并进一步探究氧化应激在MEHP所致心肌细胞损伤中的作用。方法:1.利用离体心脏灌流技术测定MEHP对大鼠离体心脏的损伤。2.细胞培养和细胞模型建立。3.利用MTT实验检测细胞存活率,DCFH-DA探针标记测定AC16细胞内和离体心脏心肌细胞内ROS水平,SCGE实验测定细胞DNA损伤情况,流式细胞仪检测细胞凋亡,全自动生化分析仪检测细胞上清液和心脏灌流液中LDH含量,流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位,大鼠离体心脏固定、包埋及染色后在显微镜下观察组织病理学变化。结果:1.MEHP可降低大鼠离体心脏左心室收缩及舒张功能、引起心率下降、大鼠心肌细胞膜受损、细胞ROS水平升高并可导致大鼠离体心脏组织发生病理学改变。2.MEHP引起AC16细胞存活率下降、细胞膜的毒性损伤、ROS水平升高、线粒体膜电位降低、DNA损伤、细胞凋亡率增加。3.抗氧化剂NAC可减弱MEHP所致的心脏损伤。4.NAC可减弱MEHP引起的AC16细胞的毒性损伤。第二部分:FOXO3a在MEHP所致AC16细胞氧化应激和凋亡中的作用目的:观察FOXO3a在MEHP所致AC16细胞氧化应激和凋亡损伤中的作用。方法:1.利用免疫荧光技术对FOXO3a和P-FOXO3a蛋白在细胞中表达及核转位情况进行观察。2.Lipofectamine 2000瞬时转染FOXO3a TM或si RNA FOXO3a建立FOXO3a高、低表达细胞株,并对FOXO3a高、低表达细胞株进行鉴定。3.运用流式细胞仪检测FOXO3a高、低表达细胞株经MEHP处理后ROS水平和细胞凋亡的变化。4.荧光定量PCR及Western blot测定单纯MEHP处理组、FOXO3a高、低表达细胞株经MEHP处理组细胞中FOXO3a、Mn-SOD、ARC的mRNA及蛋白表达情况的变化。结果:1.MEHP处理后AC16细胞中FOXO3a、Mn-SOD、ARC mRNA及蛋白表达升高,P-FOXO3a蛋白表达下降。2.经PCR和western鉴定,FOXO3a高、低表达细胞株建立成功。3.FOXO3a高表达后经MEHP处理的AC16细胞与空质粒MEHP处理的AC16细胞相比,ROS水平降低,细胞凋亡率下降,FOXO3a、Mn-SOD和ARC mRNA及蛋白进一步升高。4.FOXO3a低表达后经MEHP处理的AC16细胞与siRNA Control MEHP处理的AC16细胞相比,ROS水平升高,细胞凋亡率升高,FOXO3a、Mn-SOD、ARC mRNA及蛋白表达下降,但与FOXO3a低表达对照组相比FOXO3a、Mn-SOD、ARC mRNA及蛋白表达未发生明显变化。结论1.MEHP对离体大鼠心脏和人源心肌AC16细胞具有明显的损伤作用。2.氧化应激参与MEHP所致的心肌细胞损伤。3.FOXO3a参与调控MEHP所致的AC16细胞氧化应激和凋亡损伤。