目的:癫痫是一种最常见的大脑功能紊乱疾病,其特征是持续的自发的痫性发作,全世界有7000多万人受其影响。目前,癫痫主要的治疗方法是通过服用抗癫痫药物以控制发作症状,但是仍然有30%的患者对抗癫痫药物反应不良,难以控制癫痫发作。研究表明,癫痫发作后通常会出现神经细胞损伤甚至丢失,胶质细胞的增生,突触回路的重组和异常神经网络的形成,这可能成为下次癫痫发作甚至导致癫痫反复发作的病理基础。因此,减少癫痫发作后的神经元损伤对抑制癫痫的反复发作具有重要意义。环状RNA是一类具有闭合环状结构的RNA,越来越多的证据表明,环状RNA是癫痫等神经系统疾病的重要参与者,在疾病发生发展中发挥了关键作用。但是环状RNA参与癫痫后神经元损伤的机制尚不明确。我们的研究通过对癫痫持续状态小鼠进行高通量测序鉴定出差异表达的环状RNA circ Igf1r,探讨在癫痫发生发展中circ Igf1r调控神经元损伤的机制。方法:1.取8周龄野生型C57BL/6小鼠,腹腔注射4-氨基吡啶(4-Aminopyridine,4-AP)诱导癫痫持续状态(status epilepticus,SE),通过脑电图(Electroencephalogram,EEG)检测癫痫发作情况并对其进行癫痫行为学评分。24 h后取脑组织进行高通量测序。2.侧脑室注射环状RNA的si RNA,通过脑电图监测、行为学观察以及病理学切片检测SE的发作情况以及发作后的病理损伤表现。3.取1日龄野生型C57BL/6新生小鼠培养原代星形胶质细胞,使用Q-PCR检测4-AP以及circ Igf1r的si RNA和过表达载体对星形胶质细胞GFAP、极化表型相关marker以及环状RNA表达的影响,免疫荧光检测星形胶质细胞上circ Igf1r对原代神经元损伤的影响。4.Western blot检测4-AP以及circ Igf1r的si RNA和过表达载体对星形胶质细胞自噬相关蛋白LC3和P62表达的影响,并通过pm Cherry-EGFP-LC3B质粒监测自噬流。结果:1.从高通量测序结果筛选出四个上调的环状RNA,通过Q-PCR检测SE后候选环状RNA circ Igf1r的表达,结果显示circ Igf1r在SE小鼠模型中上调。2.EEG结果显示,体内敲低circ Igf1r的小鼠癫痫发作潜伏期延长,发作总时长缩短,发作等级降低。组织免疫荧光结果显示,SE促进星形胶质细胞向A1型极化,这种现象可以通过敲除circ Igf1r来逆转。尼氏染色结果显示SE后有神经元的丢失,敲低circ Igf1r能够减轻SE后的神经元丢失。3.Q-PCR结果显示,circ Igf1r在4-AP处理的原代星形胶质细胞上表达上调。同时,4-AP诱导原代星形胶质细胞激活并且促进星形胶质细胞更多的向A1型极化。而星形胶质细胞上circ Igf1r的敲低能够逆转细胞的表型极化。免疫荧光结果显示,4-AP处理的星形胶质细胞促进神经元的损伤,而星形胶质细胞上circ Igf1r的敲低能够缓解神经元损伤。4.Western blot结果显示,4-AP诱导星形胶质细胞自噬的发生,通过自噬双荧光质粒监测自噬流显示,4-AP导致自噬流的破坏。敲低circ Igf1r促进4-AP处理的星形胶质细胞自噬,并缓解自噬流的破坏。过表达的结果与敲低相反。5.功能挽救实验结果显示,使用自噬抑制剂能够逆转circ Igf1r敲低调控的星形胶质细胞的表型极化。结论:本课题初步研究了星形胶质细胞上circ Igf1r调控癫痫后神经元损伤的分子机制。癫痫持续状态导致星形胶质细胞的激活,并且这些激活态的星形胶质细胞更多的向A1型极化,这可能对神经元发挥毒性作用,而circ Igf1r的敲低可以缓解对神经元的损伤作用。在体外,敲低环状RNA能够促进自噬并缓解4-AP对星形胶质细胞自噬流的破坏,促进星形胶质细胞向A2型极化从而对神经元发挥保护作用。因此circ Igf1r可作为预防和治疗癫痫后神经元损伤的潜在靶点。