研究背景:甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH),又称脱氧麻黄碱,属于苯丙胺类兴奋剂(Amphetamine-Typed Stimulant,ATS),其盐酸盐为无色透明晶体,外形状如冰,俗称“冰毒”,日本化学家A.Ogata于1919年首次合成。METH作用涉及广泛,具有兴奋中枢神经、拟交感、成瘾等多种药理毒理学特性,长期吸食者可严重影响其神经系统功能。而吸毒所继发的各种暴力行为、死亡、复吸及戒断性猝死不仅是社会性的问题也和法医工作密切相关。近年来METH在国内大中城市的滥用情况仍然十分严峻,是继海洛因之后,危害最为严重和广泛的毒品,同时以甲基苯丙胺为主的新型合成毒品种类也逐渐增加滥用人员也呈现迅速的增长趋势。METH可导致多巴胺能神经元的丢失及神经胶质细胞的反应性增生,进而可能引起多种退行性疾病相关的病理学改变,而细胞骨架的异常可能与包括AD和PD在内的多种神经退行性疾病的发生及发展具有很大的关系。而近年来有文献报道GSK3β底物的阵列表明GSK3β是调节微管动力学的关键激酶,提示GSK3β激酶可能通过对细胞骨架蛋白的调节参与METH的神经毒性损伤过程。糖原合成酶激酶3β(GSK3β)属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,其功能多样化,在脑组织中普遍表达并具有广泛的底物。文献报道α-Syn能与细胞骨架蛋白tau形成聚合体,被tau特异性激酶糖原合成酶激酶3β(GSK3β)磷酸化后,共同参与包括阿尔茨海默病在内的多种神经退行性疾病。表明GSK3β可能作为细胞骨架相关蛋白的上游调节分子蛋白与帕金森病等神经退行性疾病的发病密切相关。亦有报道显示METH作用后可导致大鼠大脑副核(NAc)核心区GSK3β活性升高伴有行为学的明显改变。本教研室在关于METH神经毒性的前期研究中的实验结果显示,METH可导致细胞骨架破坏,METH可以通过激活GSK3β引起α-突触核蛋白(α-synuclein,细胞骨架相关蛋白)的表达升高及磷酸化水平升高,提示GSK3β在METH所致的细胞骨架损伤中都扮演了重要角色,并且是关键的一个靶点。亦有报道显示METH作用后可导致大鼠大脑副核(NAc)核心区GSK3β活性升高伴有行为学的明显改变。细胞骨架是主要由微管、微丝及中间丝三个部分所组成的蛋白纤维网状结构体系,对于维持细胞正常的形态结构及功能行使均起着重要作用。本教研室前期的实验数据表明,METH中毒大鼠中纹状体区神经元GSK3β特异性磷酸化产物细胞骨架蛋白stathmin(op18)表达明显升高,提示METH可能通过介导GSK3β活性的变化,影响除了 tau蛋白以外的其他相关细胞骨架蛋白。而细胞骨架相关蛋白改变和损伤是神经退行性变的病理基础,提示METH所致神经元损伤乃至退行性变可能均与METH诱导的GSK3β的活性变化有关,但目前国内外的研究结果并未阐明相应的机制,需要进一步的研究和证实。本研究拟建立METH中毒细胞模型,通过形态学、免疫荧光、GSK3β及相关细胞骨架蛋白等指标的检测,验证METH作用引起GSK3β的活性变化。再通过GSK3β抑制剂(LiCL)进一步验证GSK3β的活性变化对相关细胞骨架蛋白的影响,以期对GSK3β的活性变化而影响细胞骨架改变的可能调控机制和作用进行探讨,进一步阐明METH神经毒性作用机制,为寻找METH神经毒性损伤戒毒药物靶点提供理论基础。目的:建立METH的中毒细胞模型,通过免疫荧光、GSK3β及相关细胞骨架相关蛋白等指标的检测,从而研究METH对GSK3β活性的影响,以及GSK3β对后续相关细胞骨架相关蛋白所起的作用。再通过GSK3β抑制剂(LiCL)反证之前所得的结果,以进一步明确在METH影响下GSK3β活性变化介导的细胞骨架蛋白变化引起的细胞骨架重构,从而深入探究METH神经毒性作用机制,为寻找METH神经毒性损伤戒毒药物新的靶点提供理论基础。因此,我们拟研究GSK3β的活性变化对METH所致细胞骨架改变的可能调控机制和作用的进行探讨,进一步阐明METH神经毒性作用机制。方法:1.在分化的PC12细胞及神经元原代细胞中建立METH中毒模型(1)先用10%新生胎牛血清(FBS)的DMEM培养基于6孔板内接种PC12细胞,并在37℃和5%CO2的敷箱内培养,待细胞生长至密度达70%时,分别用含 Ommol/L、0.5mmol/L、0.1mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L 浓度 METH 的2%血清培养基培养24小时,然后提取细胞总蛋白,用Western Blot法检测细胞磷酸化GSK3β(P-GSK3β)的表达变化情况,以此综合并选取合适浓度建立细胞中毒模型。(2)将新生SD大鼠皮层神经元细胞用无胎牛血清(FBS)的专用神经元培养基接种6孔板中,细胞密度以70%为宜,在37℃和5%CO2条件下培养,待培养5-7天神经元形态趋近成熟时,分别用含Ommol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.Ommol/LMETH的无血清神经元专用培养基于恒温敷箱内培养24小时后提取细胞总蛋白,再用Western Blot法检测磷酸化GSK3β(P-GSK3β)的表达变化情况,以此综合并选取合适浓度建立细胞中毒模型。2.探究GSK3β在METH诱导细胞骨架重构中的作用机制分别将PC12细胞和新生SD大鼠皮层神经元细胞分别接种于6孔板中,在37℃和5%C02条件下培养。待PC12细胞长至70%汇合时,用含Ommol/L、0.5mmol/L、0.1mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/LMETH 的 2%血清培养基于恒温敷箱内继续培养24小时,后提取细胞内总蛋白;待神经元原代细胞培养5-7天形态趋近成熟神经元时,用含 0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L METH的无血清神经元专用培养基于恒温敷箱内培养24小时后提取细胞总蛋白,再用Western Blot法分别检测细胞内细胞骨架相关蛋白水平的变化情况。接种PC12细胞及神经元原代细胞分别至6孔板培养皿中并将细胞分为4组:空白对照组(CON)、对照+抑制剂组(LiCL)、给药组(METH)、给药+抑制剂组(METH+LiCL),其中在对照+抑制剂组(LiCL)及给药+抑制剂组(METH+LiCL)内提前加入抑制剂(LiCL)处理30分钟后,再加入合适浓度的METH进行给药处理,分别培养24小时后,收集细胞或细胞液进行以下各项实验:(1)于倒置显微镜下观察各组PC12细胞的形态学异常改变。(2)用Western Blot法分别对细胞骨架相关蛋白包括APC、磷酸化的TAU(P-TAU)、磷酸化的 CRMP2(P-CRMP2)、磷酸化的 STATHMIN(P-OP18)表达进行检测。(3)采用共聚焦显微镜观察细胞内微丝以及微管的变化。结果:1.PC12细胞及神经元原代细胞中METH中毒模型的建立经METH处理后的PC12细胞以及神经元原代细胞相较空白对照组GSK3β的磷酸化水平随METH浓度增加逐渐增高。其中,在PC12细胞内,当METH浓度大于1.0mmol/L时,磷酸化GSK3β(P-GSK3β)升高与对照组相比均有显著性差异(p<0.05);而在神经元原代细胞内,当METH浓度大于0.4mmol/L时,P-GSK3β升高与对照组相比均有显著性差异(p<0.05)。当加入2.0 mmol/LGSK3β抑制剂LiCL时,可显著抑制METH引起的PC12细胞以及神经元原代细胞内GSK3β活性表达升高.2.探究GSK3β在METH诱导细胞骨架重构中的作用机制(1)Western Blot检测结果显示,相比于空白对照组,经METH处理的PC12细胞以及神经元原代细胞内细胞骨架相关蛋白包括Tau、CRMP2、OP18的磷酸化水平及APC的表达均随METH浓度增加而逐渐增高。(2)4组细胞模型分别经过不同的处理24h后,倒置显微镜下观察PC12细胞的形态变化,可见METH组与CON组的细胞形态相比有了明显改变,可见胞体大体变圆,突起变短甚至消失,部分细胞脱壁漂浮;CON+LiCL组细胞形态与CON组相比无明显变化;而METH+LiCL组相较于METH组,无论是胞体还是突起损伤均有了明显的改善。(3)Western Blot法检测PC12细胞以及神经元原代细胞内各组细胞骨架相关蛋白表达发现:CON+LiCL组细胞内APC总蛋白及TAU、CRMP2、OP18的磷酸化蛋白表达水平相比于CON组并无明显变化,METH组细胞内APC总蛋白及TAU、CRMP2、OP18的磷酸化蛋白表达水平相比于CON组显著升高(p<0.05),而METH+LiCL组细胞内APC总蛋白及TAU、CRMP2、OP18的磷酸化蛋白表达水平相比于METH组显著降低(p<0.05)。(4)在共聚焦显微镜下观察可见:在PC12细胞内,METH组细胞内微丝及微管较CON组排列上有一定程度上的紊乱。而在神经元原代细胞内,METH组除了胞内微丝及微管较CON组排列上的异常变化外还可发现轴突的缩短及细胞边缘毛刺状的改变。结论:1.磷酸化的GSK3β在METH处理的PC12细胞株以及神经元原代细胞内表达显著上调,且上调趋势随METH浓度的增高而升高。GSK3β抑制剂LiCL可有效抑制GSK3β磷酸化水平的升高。2.METH可诱导细胞内GSK3β的磷酸化而引起GSK3β活性水平的升高,活化的GSK3β可以使下游的细胞骨架相关蛋白包括APC、TAU、CRMP2、OP18水平升高或发生磷酸化导致细胞骨架的紊乱进而重构,引起神经元退行性变。GSK3β抑制剂LiCL则可有效抑制这一过程从而抑制METH的神经毒性。