第一部分：肾脏晚期缺血预适应大鼠模型的建立背景和目的：急性肾衰竭(ARF)是一种常见的临床危重病症，缺血／再灌注(I／R)损伤是导致ARF的重要因素。因此，寻找特异性干预手段来预防和治疗急性缺血性肾衰竭是肾脏病学界亟待解决的重要问题。缺血预适应(IPC)是迄今为止发现的最强有力预防缺血性器官损伤的内源性措施，但其机制尚不清楚。IPC具有双时相保护作用，分别称为早期缺血预适应和晚期缺血预适应，后者又称为延迟性IPC，其保护作用在预缺血12-24小时后出现，持续几天甚至数周。晚期IPC由于需要合成新的蛋白质、保护作用更持久稳定，易于研究和模仿等特点，与早期IPC相比更受到研究者的关注。但是，要深入研究一个现象的内在机制，必须要有一个好的实验模型。现在国内外尚未建立稳定、高效的肾脏晚期缺血预适应动物模型。本研究旨在通过比较不同预缺血方式的近期和远期保护效果，来构建较理想的肾脏晚期IPC大鼠模型。材料和方法：健康雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为7组：(1)假手术对照组(Sham／Sham)，只分离两侧肾蒂，不进行夹闭；(2)缺血再灌注组(Sham／I)，没有缺血预处理，用无损伤动脉夹夹闭两侧肾蒂40min，然后恢复灌注；(3)10min缺血预处理组(I-10／I)，第0天夹闭两侧肾蒂10min，造成预缺血，间隔一定时间后，再次缺血40min；(4)15min缺血预处理组(I-15／I)；(5)20min缺血预处理组(1-20／I)；(6)25min缺血预处理组(I-25／I)；(7)30min缺血预处理组(I-30／I)。预缺血和再次缺血的间隔时间分别设为1、2、4、8、16和28d。第二次缺血后观察时间分别为48h、5周和10周。每组每个时间点n=6。采用酶法测定血清肌酐(Scr)浓度、尿素酶-GLDH法测定尿素氮(BUN)浓度来评价肾功能；HE、Masson及天狼猩红染色观察肾组织的病理改变，采用Western blot和免疫组织化学法检测5周后纤维化相关因子(α-SMA、TGF-β1和phospho-Smad2)在肾组织的表达和分布。最后综合各组近期和远期的肾脏功能和组织形态学来判断不同缺血预适应方式的肾脏保护效果。结果：1)与假手术组(Scr 25.52±3.01μmol／L，BUN 5.29±0.88mmol／L)相比，Sham／I组再灌注后48小时的Scr、BUN浓度显著升高(Scr 573.85±29.64μmol／L，BUN 69.36±3.45mmol／L，P＜0.001)；在两次缺血间隔时间为8d的情况下，10min缺血预处理组的肾功能改善作用最差(Scr 553.34±76.86μmol／L，BUN 67.33±13.00mmol／L)；15min缺血预处理组有部分肾功能改善作用(Scr 155.93±81.83μmol／L，BUN 34.31±9.75mmol／L)；I-20／I(Scr 41.02±5.22μmol／L，BUN9.95±0.65mmol／L)、I-25／I(Scr 37.86±8.95μmol／L，BUN 8.41±3.53mmol／L)和I-30／I组(Scr 40.98±11.41μmol／L，BUN 6.63±1.90mmol／L)均有显著肾功能改善作用，Scr较对照组下降90％以上，而这三组之间相互比较没有统计学差异。2)改变两次缺血的间隔时间(1、2、4、8、16和28d)，与缺血再灌注组比较，20、25和30min缺血预处理组仍有显著的肾功能保护作用(P均＜0.001)；三组都呈现肾功能保护效应逐渐增强又逐渐降低的趋势，20和25min缺血预处理组在间隔时间4和8d的Scr和BUN浓度最低，30min缺血预处理组在间隔时间8和16d的Scr和BUN浓度最低。3)在间隔时间固定为8d的情况下，Sham／I组再灌注后48h皮髓交界处和外髓质小管间质损伤最严重，损伤评分最高(3.53±0.22)，与Sham／I组相比，10min缺血预处理没有明显改善肾组织形态学(3.42±0.29)；15min缺血预处理对肾小管间质损伤只有部分改善作用(1.55±0.21)；20和25min缺血预适应组损伤评分最低(I-20／I0.21±0.08，I-25／I0.22±0.15)；30min缺血预处理组偶有肾小管上皮细胞坏死，但出现了明显的小管变形(包括萎缩和扩张)、基底膜增厚、间质区增宽等病理改变(与第二次缺血前相一致)，小管间质损伤积分(1.01±0.29)显著高于I-20／I和I-25／I组(P＜0.001)。4)术后5周10min缺血预处理组的小管间质纤维化病变与缺血再灌注组相似(Sham／I18.92±2.63％，I-10／I 17.50±3.16％)；30min缺血预处理组的肾脏纤维化明显加重(25.30±3.78％)，并伴有肾脏重量的增加和肾功能的减退；相反，20min缺血预处理组的肾脏纤维化显著减轻甚至消失(1.12±0.49％)。把观察时间延长到缺血后10周，天狼猩红染色发现，各组之间小管间质纤维化病变程度比较仍有类似缺血后5周的趋势。5)与假手术组比较，缺血后5周Sham／I和I-10／I组的α-SMA、TGF-β1和phospho-Smad2蛋白表达增强；在I-30／I组上述蛋白表达进一步上调，肾组织α-SMA、TGF-β1分布与小管间质纤维化病变区域一致；20min缺血预处理组α-SMA、TGF-β1和phospho-Smad2弱表达。结论：1)在一定范围内，缺血预处理的时间越长，对再次缺血的保护效果(对肾脏结构、功能的保护强度和持续时间)越好，超过这个范围后，既使再延长预缺血时间，保护效果也不会明显增加，反而会加重小管间质纤维化；2)肌成纤维细胞增多(α-SMA阳性)和TGF-β1／Smad信号通路激活可能参与了缺血性肾间质纤维化病理过程；3)20min缺血预处理具有显著的近期和远期肾脏保护作用；4)适应性预缺血和损伤性缺血之间要有一个合适的间隔时间。采用预缺血20min—间隔4到8d—再次缺血40min的方法，可成功构建稳定、高效的肾脏晚期缺血预适应大鼠模型。第二部分：晚期缺血预适应对肾脏保护作用的机制研究背景和目的：肾脏固有细胞的命运决定了肾脏疾病的凶险程度和预后。大量肾小管上皮细胞坏死是缺血性ARF的重要病理特征，炎症反应和微循环障碍在其中发挥了重要的作用。IPC能显著减轻甚至逆转缺血性ARF，但细胞和分子机制尚不清楚。在成功建立肾脏晚期缺血预适应大鼠模型的基础上，我们拟探讨IPC对小管上皮细胞死亡及增殖修复、NF-κB相关炎症反应和血管活性物质的影响。材料和方法：SD大鼠随机分为3组：(1)假手术组(Sham)，只分离两侧肾蒂，不进行夹闭；(2)单纯缺血再灌注组(I／R)，第0天假手术，第4天用无损伤动脉夹夹闭两侧肾蒂40min，然后恢复灌注；(3)缺血预适应组(IPC)，第0天预缺血20min，第4天再次缺血40min。再灌注后4h、24h、48h、72h处死大鼠(每个时间点n=6)，收集血样和肾脏标本，进行生化、病理及分子生物学分析。PAS染色观察肾组织形态学；透射电镜观察小管上皮细胞和血管内皮细胞的超微结构；原位末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡情况；Western blot检测IκB-α、eNOS蛋白表达；免疫组织化学法观察PCNA、ED-1、ICAM-1、TNF-α、p65、HIF-1α和HO-1在肾组织的分布；荧光定量实时PCR检测ICAM-1、TNF-α、eNOS、ET-1和HO-1的mRNA表达；ELISA、放射免疫法分析血或肾组织巨噬细胞炎性蛋白—2(MIP-2)、内皮素—1(ET-1)和PGI2代谢产物(6-keto-PGF1α)含量；凝胶电泳迟滞分析(EMSA)检测NF-κB／DNA结合活性。结果：1)再灌注后4h，IPC组的Scr浓度较I／R组明显降低(63.69±12.19μmol／L vs．109.89±15.73μmol／L，P＜0.001)，同时伴有血AST和尿NAG酶活性较I／R组显著降低(AST 329.75±22.13IU／L vs．834.88±225.50IU／L，P＜0.001)(NAG 34.42±9.63IU／L vs．51.34±7.49IU／L，P＜0.01)；再灌注后48h，IPC组的肾功能保护作用达到了最高峰(36.26±6.89μmol／L vs．575.93±36.26μmol／L，P＜0.001)，显著改善了大鼠存活率(100％vs．68％)。2)再灌注后48h，PAS染色和透射电镜显示I／R组肾小管上皮细胞大量坏死，同时伴有炎性细胞浸润，20min缺血预处理组肾小管坏死面积百分比(ATN％)显著降低(4.03±1.62％vs．69.17±8.93％，P＜0.001)，Scr浓度与ATN％呈显著正相关(r=0.99，P＜0.001)；肾小管上皮细胞凋亡情况(TUNEL阳性细胞／400倍光镜)，与Sham组(5.4±1.0／HPF)相比，I／R组(20.2±3.5／HPF)和IPC组(14.8±4.3／HPF)都有少量的肾小管上皮细胞凋亡；细胞增殖核抗原(PCNA)染色分析显示，缺血预适应组PCNA阳性细胞数较I／R组明显增多(35.5±5.4 vs．20.1±4.0，P＜0.001)，排列规则，电镜表现为特征性的M期增殖细胞形态，细胞增殖指数在IPC组最高。3)再灌注后24h，IPC组肾脏单核巨噬细胞(ED-1阳性)浸润较I／R组明显减少(6.2±1.2／HPF vs．25.3±3.5／HPF，P＜0.01)，同时，IPC组肾组织MIP-2蛋白含量显著降低(P＜0.001)。4)与Sham组相比，I／R组ICAM-1、TNF-α蛋白和mRNA表达都明显增强(P均＜0.05)，两者主要分布在皮髓交界处和外髓质部肾间质或小管上皮细胞；IPC组ICAM-1和TNF-α表达减弱，与Sham组比较无显著性差异(P＞0.05)。5)与Sham组相比，I／R组NF-κB亚单位p65阳性核显著增多，NF-κB抑制蛋白IκB-α表达明显减少(P＜0.05)，EMSA分析显示NF-κB／DNA结合活性增强(P＜0.05)；IPC组的NF-κB／DNA结合活性几乎完全被抑制，与FR组比较，有显著性差异(110±9％vs．159±12％，P＜0.05)。6)再灌注后24h，I／R组大体标本瘀血严重，透射电镜显示管周血管内皮细胞变性，肿胀突出入管腔，细胞间连接疏松，渗透性增加，Sham组和IPC组内皮细胞结构完整，连接紧密。7)与I／R组比较，IPC组血浆(93.64±20.66pg／ml vs．116.76±15.55pg／ml，P＜0.05)和肾组织ET-1含量(108.20±15.48pg／mg protein vs．136.73±4.33pg／mg protein，P＜0.05)均明显减少，同时IPC组ET-1 mRNA表达也显著下调(0.89±0.25 vs．1.74±0.86，P＜0.05)；经20min缺血预处理后，IPC组的内皮源性NO合酶(eNOS)蛋白表达进一步上调，与I／R组比较，有显著性差异(0.20±0.07 vs．0.12±0.03，P＜0.05)，而各组间eNOS的mRNA表达无统计学差异；IPC组血清6-keto-PGF1α含量较I／R组明显增加(41.05±14.89pg／ml vs．21.57±6.67pg／ml，P＜0.05)。8)与Sham组相比，I／R组HIF-1α阳性细胞核在内髓质集合管分布较多，其次沿外髓质部坏死小管周围残存细胞分布；缺血预处理后HIF-1α分布范围和表达强度都进一步增加，IPC组外髓质外带平均每视野(×200)HIF-1α阳性细胞核数目，较I／R组明显增多(P＜0.001)；肾组织血红素氧合酶—1(HO-1)表达强度和分布区域与HIF-1α一致。结论：1)晚期缺血预适应能够减少小管上皮细胞坏死和凋亡，促进其增殖修复；2)IPC抑制了NF-κB相关的炎症反应；3)IPC通过保护血管内皮细胞结构及调节血管舒缩物质表达，改善了再灌注后微循环功能；4)IPC通过诱导HIF-1α高表达，增加小管上皮细胞的耐缺血缺氧能力。总之，晚期缺血预适应能够通过抑制再灌注后炎症反应、改善血供及提高细胞对缺氧的耐受力等途径，改变小管上皮细胞的命运，从而最大程度维持了肾脏结构和功能的完整性。