论文部分内容阅读
淀粉酶是已商业化且应用最广泛的酶制剂之一,随着淀粉应用范围的不断扩展,对淀粉酶的酶学性质要求会越来越多、越来越专业化以适应不同类型的反应。发现和改造获得更多的具有特殊性质的酶资源,为淀粉酶的工业化应用提供必要的前提条件。
本研究从自然界筛选到两株高产淀粉酶的野生菌株,初步鉴定为链霉菌属(Streptomycessp.)和芽孢杆菌属菌株(Bacillussp.),分别命名为GXT-6和GXBA-4。利用简并PCR成功地从菌株Streptomycessp.GXT-6的基因组DNA中克隆到一个α-淀粉酶基因,并在大肠杆菌成功表达。通过酶学性质研究,该酶的最适温度为55℃,最适pH为7.0,高效液相色谱技术(HPLC)检测其水解淀粉产物主要为麦芽糖、麦芽三糖以及麦芽四糖,不含有葡萄糖,在麦芽糖浆生产工业上有很大的应用前景。
利用超滤,凝胶过滤和硫酸铵沉淀等方法从野生菌Bacillussp.GXBA-4的发酵液中分离纯化到单一的α-淀粉酶组分,利用质谱技术(MS)测定该酶的部分氨基酸序列,从而成功的克隆到Bacillussp.GXBA-4α-淀粉酶基因,并成功表达。通过酶学性质研究发现,该酶的最适温度为40℃-45℃,最适pH为5.0,产物为葡萄糖、麦芽糖及麦芽三糖等多种低聚糖混合物,是一种偏低温酸性α-淀粉酶,在食品和淀粉加工行业将有一定的应用前景。
本研究以已有三维晶体结构的Bacillusamyloliquefaciens的α-淀粉酶(PDBID为3BH4A)为模板,通过SWISS-MODEL网站对Bacillusamyloliquefaciensα-淀粉酶基因进行同源建模,通过ProSa2003能量分析软件预测,对Bacillusamyloliquefaciens的α-淀粉酶催化位点附近的Q295、P362进行了定点饱和突变,结果获得4个有淀粉酶活力的突变子Q295G、Q295Y和P362E、P362Y。与野生酶相比,Q295G和Q295Y的比活力稍有提高,P362E比活力下降了20倍,P362Y下降了1倍;对突变酶进行酶学分析,其最适温度和最适pH以及产物都没有很大的变化,Q295G和P362Y的最适温度分别提高和降低了5℃;Q295G、Q295Y和P362E最适pH提高了0.5-1个单位;P362E和P362Y水解淀粉生成葡萄糖的量略有减少。