一、研究背景： 缺血性脑卒中是最常见的中枢神经系统(central nervous system，CNS)疾病，是目前致残和致死的主要原因之一，给社会和家庭带来沉重的负担，其中最常见的是大脑中动脉供血区的脑梗死，约占脑梗死的75％左右。 在急性脑梗死的治疗中，虽然超急性期组织纤溶酶原激活物和尿激酶的溶栓治疗能取得明显的疗效，但溶栓治疗时间窗小，并有其潜在的出血风险，限制了它的广泛应用。以神经干细胞(neural stem cells，NSCs)和造血干细胞(haemopoietic stem cells，HSCs)为主的细胞替代治疗近年来也取得较明显的疗效，但NSCs的不易获得性和HSCs来源上的伦理问题，以及细胞移植存在的包括免疫排斥、感染及诱发恶性肿瘤风险等一系列问题都限制了干细胞的发展与应用，因此利用药物刺激增强自体内源性干细胞的修复功能成为新的研究靶向热点。此时，粒细胞集落刺激因子(Granulocyte-colony stimulating factor，G-CSF)做为内源性HSCs的强力动员剂在CNS疾病的治疗中引起了研究者极大的关注。 G-CSF在骨髓造血系统中能选择性刺激粒细胞及其前体细胞的增殖、分化和成熟，已被广泛用于干细胞的动员、骨髓重建以及血液系统疾病、恶性肿瘤化疗等引起的粒细胞减少症的治疗中。随着G-CSF及其受体(G-CSFR)在非造血系统的发现，已有越来越多的研究证明，G-CSF在包括CNS在内的非造血系统里尚有重要的功能，如在小鼠脓毒血症中，G-CSF具有抗炎作用，在多种自身免疫性疾病中具有免疫调节作用等。而且越来越多的研究证明，G-CSF在动物脑缺血模型中，能刺激内源性神经再生，动员骨髓HSCs入血并向脑组织缺血区靶向迁移“归巢”，促进新生血管的形成，G-CSF能与G-CSFR的结合还能导致直接抗凋亡作用，因而具有强大的神经保护作用，G-CSF治疗后动物脑水肿减轻、梗死体积减小、死亡率降低，神经功能预后改善，但G-CSF是否能通过调节趋化因子的表达及T细胞的分泌功能来影响脑梗死的炎症病理过程尚未明确。 二、研究目的: 本课题通过建立大鼠永久性局灶性大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型来试图阐明G-CSF是否能通过调节趋化因子的表达及T细胞的分泌功能来影响脑梗死的炎症病理过程，同时进一步验证G-CSF在脑梗死中的抗凋亡及促进神经、血管再生等保护机制，为G-CSF在脑梗死中的临床应用提供更进一步的理论依据。 三、材料与方法: 1.线栓法建立大鼠永久性MCAO模型； 2.动物分组与干预：A组：在MCAO术后2h开始给予单剂量G-CSF(50ug/kg)皮下注射治疗一次，24h后取脑组织行RT-PCR、Western-blot及免疫组化检测，同时设立相应的假手术组(sham)与PBS对照组(control)(n=6)；B组：在MCAO术后2h开始给予G-CSF(50ug/kg)皮下注射连续治疗3天，并在G-CSF治疗前予BrdU 50mg/kg腹腔注射，连续标记3天，MCAO术后14d取脑，用于免疫荧光检测，设立相应PBS对照组(control)(n=8)； 3.TTC染色测定大鼠MCAO术后24h脑梗死体积； 4.对所有入组大鼠MCAO术后3d、7d、14d进行平衡木试验与网屏试验评价大鼠运动功能情况； 5.实时RT-PCR方法测定MCAO术后24h大鼠脑组织缺血区域TNF-α、TGF-β、IL-10等炎症相关因子及趋化因子MCP-1 mRNA的表达水平； 6.免疫组化方法检测MCAO术后24h中性粒细胞表面标记CD11b在大脑缺血区中的表达情况； 7.免疫组化与Western-blot方法测定MCAO术后24h脑组织缺血区抗凋亡蛋白Bcl-2与促凋亡蛋白Bax的表达； 8.免疫荧光双标法测定MCAO术后14d脑内由标志新生细胞的BrdU与神经元(NeuN)、血管内皮细胞(vWF)及星形胶质细胞(GFAP)的共表达情况。 9.统计学分析：所有数据采用-x±s表示，两组间比较用t检验，三组间比较用One-Way ANOVA方差分析，P＜0.05表示具有统计学意义。 四、结果： 1.G-CSF治疗组TTC染色所示梗死体积较PBS对照组明显减小(P=0.001)： 2.G-CSF治疗组大鼠7d、14d的运动功能较PBS对照组改善； 3.在脑组织缺血区域，G-CSF治疗组MCP-1mRNA水平较PBS对照组明显减少(P=0.03)；IL-10、TGF-β mRNA水平增高(P值分别为0.01、0.004)，但TNF-α mRNA水平在两组间无统计学差异(P=0.88)； 4.MCAO术后24h CD11b在G-CSF治疗组与PBS对照组中的表达差异无统计学意义(P=0.61)； 5.在大鼠脑组织缺血区域，G-CSF治疗组抗凋亡蛋白Bcl-2的表达较PBS对照组明显增高(P=0.02)，促凋亡蛋白Bax水平较PBS对照组显著降低(P=0.007)： 6.G-CSF治疗组BrdU阳性细胞数较PBS对照组明显增)31(P＜0.001)，BrdU与NeuN、GFAP及vWF双阳性细胞数增多。 五、结论： 1.在大鼠MCAO模型中，G-CSF治疗能减少梗死体积，改善运动功能的 恢复； 2.在大鼠MCAO模型中，G-CSF治疗能减少脑组织缺血区域趋化因子MCP-1 mRNA的表达；增加抗炎因子IL-10、TGF-β mRNA的表达，但对TNF-α mRNA水平无明显影响； 3.在大鼠MCAO模型中，G-CSF具有抗凋亡作用； 4.在大鼠MCAO模型中，G-CSF治疗能促进神经元、星形胶质细胞及血管内皮细胞的再生，促进神经网络的重建。