抗菌肽是鱼、虾、贝等非特异性免疫防御系统的主要成分之一，在防御外源性病原体入侵方面起着重要作用。作为一类独特的天然免疫活性物质，抗菌肽具有广谱的抗微生物活性和免疫调节活性。迄今从鱼类、甲壳动物、贝类等海洋动物中已分离获得了多种不同类型的抗菌肽，并揭示了其基因和蛋白结构以及表达特性、抗微生物活性以及某些抗菌机理;现有试验结果亦逐渐证明抗菌肽有望作为抗生素一定程度的替代品，在水产养殖业及其他行业具有应用前景，但迄今对其有效利用途径且进入机体后的免疫效应知之甚少。　　天然运载载体（如细菌、病毒和哺乳动物细胞等）具有良好的体内功能和药物运载载体特性，活菌载体是其中广泛应用的载体系统之一，可将目的蛋白基因插入活细菌的染色体或质粒载体中，将目的蛋白基因运送到机体内发挥作用。口服免疫途径是未来抗菌肽产品有效应用于鱼类等养殖业的主要途径，目前主要以基因工程产品形式作为饲料添加剂应用，而活菌载体系统是否可作为抗菌肽的有效利用途径之一值得深入研究。本论文在已获得的黑鲷抗菌肽Hepcidin和拟穴青蟹Scygonadin1(Scy1)基因及相关抗菌活性与部分功能的研究基础上，利用减毒沙门氏菌作为活菌载体，将两种抗菌肽基因克隆到减毒沙门氏菌，通过口服途径，研究了运载抗菌肽的减毒沙门氏菌载体在鱼体中应用的可行性、安全性和有效性，该项探索性研究为抗菌肽未来在水产养殖业中的应用提供了一种新思路。主要研究成果如下:　　1、建立黑鲷抗菌肽hepcidin前体（AS-prohepc2）的原核表达系统:人工合成AS-hepc2和AS-hepc6成熟肽，抗菌谱研究结果显示两种多肽均具有广谱的抑杀菌活性。利用已获得的黑鲷AS-hepc2基因进一步构建大肠杆菌pET28a/AS-prohepc2原核表达体系，可稳定表达可溶性AS-prohepc2前体蛋白，体外抗菌试验结果显示，AS-prohepc2能抑制革兰氏阳性和阴性菌生长。　　2、证明青蟹抗菌肽Scy1真核表达产物体内、外均具有抗菌活性:利用毕赤酵母真核表达系统获得Scy1蛋白产物，体外试验发现Scy1真核表达产物共孵黑鲷巨噬细胞可增强其对嗜水气单胞菌吞噬功能。进一步利用模式生物斑马鱼观察了其在体内的抗菌功能，研究发现Scy1与嗜水气单胞菌共注射或预注射斑马鱼，可在感染早期推迟死亡的爆发，对斑马鱼起到一定保护作用。　　3、体内外过表达试验证明了利用转运系统导入抗菌肽的可行性:将Scy1和AS-prohepc2的真核表达载体导入鲤鱼EPC细胞进行过表达。前者细胞培养上清中共孵的金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、嗜水气单胞菌和荧光假单胞菌具有生长抑制作用。而后者则无明显抗菌功能。利用肌肉电转化方式，将Scy1真核表达载体导入模式生物斑马鱼体内进行过表达。斑马鱼嗜水气单胞菌感染实验显示肌肉过表达Scy1对斑马鱼起到一定程度的保护作用，说明Scy1基因通过转运系统进入机体有效发挥免疫作用具有可行性。　　4、减毒鼠伤寒沙门氏菌携带抗菌肽基因运载系统的建立及其初步应用研究:以减毒鼠伤寒沙门氏菌作为活菌载体，构建青蟹抗菌肽Scy1基因或蛋白运载系统，在海洋鱼类黑鲷体内进行了体内定植、表达、安全性及免疫功能等一系列研究。　　(1)构建Scy1原核及真核表达载体:原核载体pYA248可表达asd基因，与asd缺失的沙门氏菌减毒株X4072互补形成平衡致死系统。真核载体pCMV-HA-asd载体将pCMV-HA载体的卡那霉素抗性基因替换为asd基因，从而构成平衡致死系统，使目的基因更加稳定地在动物体内表达。此外在pCMV-HA-asd载体的基础上构建分泌型载体pCMV-ScySP-HA-asd，使Scy1基因在细胞中表达后可分泌到细胞胞外。本研究通过Western blot在体外水平验证了这四种载体Scy1的蛋白表达。　　(2)初步确定了沙门氏菌在黑鲷消化道的定植条件和时间:黑鲷经灌胃处理减毒沙门氏菌后，通过肠道组织匀浆液涂布培养基实验表明减毒沙门氏菌可在肠道中定植长达20天，而减毒志贺氏菌仅能定植10天左右;将减毒沙门氏菌直接灌胃黑鲷后在消化道可检测到大量沙门氏菌，而将沙门氏菌悬液与饲料混合饲喂黑鲷的定植效果较差;携带平衡致死宿主载体系统的沙门氏菌可定植20天，相反，自杀型载体沙门氏菌仅能在胃肠道定植5天左右。此外，减毒沙门氏菌在黑鲷肠道中逐渐减少并最终排出体外，显示其作为基因治疗载体的安全性。　　(3)揭示减毒沙门氏菌在体内的组织分布和蛋白表达情况:灌胃减毒沙门氏菌后，除了在胃肠道中分离培养到减毒沙门氏菌，肝脏、肾脏、脾脏也有较多沙门氏菌定植，心脏和鳃中有极少沙门氏菌，血液和肌肉中未检测到沙门氏菌。灌胃沙门氏菌体系X4072（pYA248/Scy1）在胃、肠道、脾脏、肾脏、肝脏、鳃等器官中均检测到Scy1的基因表达。其中Scy1在肠道和脾脏中表达持续时间较长。沙门氏菌与Scy1真核表达质粒运载系统在体内定植试验发现，利用平衡致死系统沙门氏菌X4072(pCMV-HA-Scy1-asd)可在黑鲷肠道和脾脏的切片中检测到Scy1，而自杀型沙门氏菌X4072(pCMVHA/Scy1)仅在肠道切片中检测到Scy1。　　(4)对灌胃减毒沙门氏菌后的黑鲷进行了安全性评价:研究发现，灌胃减毒沙门氏菌7d后氧化应激指标(SOD、T-AOC、MDA、NO)、免疫相关指标(LSM)、肝损伤指标(GOT, GPT)与生理盐水和空白对照组相比均没有显著改变，说明各浓度沙门氏菌对黑鲷的正常生理状态无损伤作用。当高浓度沙门氏菌运载Scy1基因在黑鲷体内表达后，与空载体组相比，SOD活性和MDA量升高，活性氮自由基NO也有一定程度上升，说明Scy1在鱼体内表达后可能引起黑鲷活性自由基增加，导致抗氧化系统的激活。另外黑鲷部分肠道组织结构，在口服高浓度（109 cfu/尾）沙门氏菌后小肠绒毛增厚、空泡增加，可能引起肠道的轻微病理变化。因此，黑鲷给予口服量108 cfu/尾及以下浓度的减毒沙门氏菌X4072具有安全性。　　(5)灌胃后对黑鲷免疫相关基因表达的影响:灌胃减毒沙门氏菌X4072（pYA248/Scy1）后，黑鲷IL-1β基因的表达有明显提高(P=0.013)，CCL-4、IL-8、TNF-α、TLR9、LZM等基因表达也有诱导趋势;而灌胃减毒沙门氏菌真核表达体系后，黑鲷免疫相关基因的表达变化较小，说明Scy1蛋白经沙门氏菌运载进入黑鲷体内后对大部分所测的免疫相关基因有诱导作用但无显著影响。　　综上所述，减毒沙门氏菌运载抗菌肽具有可行性、安全性和有效性，可作为抗菌肽在水产养殖业中口服有效利用的候选途径之一。