丙烯酰胺(ACR)是一种有机化工原料,自1949年合成以后,广泛应用于合成聚丙烯酰胺等上百种产品,在电泳分离蛋白质的实验中也常被应用。在日常生活中人们接触ACR的途径有多种,近年来研究发现,除职业性接触ACR外,人们还可以通过吸烟、化妆品、食物包装材料,甚至通过食物性经口摄入,如饮用水、油炸薯片、薯条、高温烘烤的面包等摄入大量ACR,其危害日益引起人们的高度重视。经过几十年的研究,人类对ACR的毒性有了较充分的认识,它是一种蓄积性毒物,具有明显的神经毒性、雄性生殖毒性以及可疑的致癌性,但在人类中只有神经毒性得到确认。目前,ACR究竟如何启动神经毒性作用,其机制还不明。有研究表明氧化损伤可能是ACR神经毒性的机制之一,且一些抗氧化剂可以减轻ACR引起的毒性作用,如维生素C和维生素E。褪黑素(MT)是体内松果体腺分泌的一种激素。近年来研究表明,MT具有广泛的药理生理作用,在延缓衰老、肿瘤生长及防止某些神经退行性病变方面有很好的调控作用,并且认为MT是相当安全的。而MT的这些作用与其强抗氧化性是分不开的。MT是目前已知的最强的抗氧化剂,可以通过直接或间接的作用发挥抗氧化性,表现为清除自由基以及提高机体抗氧化酶活性。本研究拟通过体内试验,建立大鼠ACR亚慢性中毒模型及MT干预模型,研究ACR对大鼠的一般毒性和神经毒性作用及其机制,探讨MT干预下是否能缓解ACR的毒性作用,为深入阐明ACR的毒作用机制,并为探索防治ACR神经毒性方法提供参考依据。第一部分MT干预下ACR对大鼠的一般毒性作用目的:探讨MT同时干预下ACR对大鼠一般毒性作用的研究。方法:40只健康成年雄性SD大鼠按体重随机分为4组,即对照组、ACR组、MT组、联合组(MT+ACR组),每组10只,均单笼饲养。采用自由饮水染毒的方式,对照组饮用灭菌蒸馏水;ACR组饮用浓度为2.3 mmol/L的ACR溶液;MT组饮用灭菌蒸馏水,腹腔注射2.5㎎/㎏ MT,1次/d;联合组饮用浓度为2.3 mmol/L的ACR溶液,同时腹腔注射2.5㎎/㎏ MT,1次/d。连续9周。每周记录大鼠饮水量、进食量、体重增长。染毒结束后,各组大鼠均断头处死,称量重要脏器,并计算其脏器系数,测定大鼠血清生化指标。结果:在本模型中,(1)与对照组比较,ACR组大鼠食物利用率和周末平均体重自第2周始明显降低,大脑和小脑脏器系数增高,ALB、Cr显著下降(P <0.05)。(2)与对照组比较,MT组大鼠第7、8周末平均体重明显降低,ALB、TP显著下降(P <0.05)。(3)与对照组比较,联合组大鼠食物利用率自第3周明显下降,周末平均体重自第2周始显著降低,大脑、小脑、睾丸脏器系数增高,ALB、TP、ALP、Cr明显降低,GLU明显增高(P <0.05)。(4)与ACR组相比,联合组大鼠第8周末平均体重明显下降,大脑脏器系数有所增高(P <0.05)。结论:ACR对大鼠一般毒性作用主要表现为食物利用率下降,体重降低,大脑和小脑脏器系数增高。MT同时干预后,对大鼠一般毒性无明显缓解作用。长期使用MT对大鼠体重有一定的影响。第二部分MT干预下ACR对大鼠的神经毒性作用一、MT干预下ACR对大鼠神经行为改变的影响目的:探讨同时给予MT处理对ACR引起大鼠神经行为改变的研究。方法:试验动物及分组同第一部分(每组10只)。采用神经行为学评价方法,分别于染毒前后每周对各组大鼠进行步态评分,记录的分值为1～4分,步态改变越明显,分值越高。结果:在本模型中,(1)ACR组和联合组大鼠从第3周开始步态出现明显改变,后肢无力、足张开,染毒结束时,部分大鼠出现后肢完全瘫痪,与对照组相比,步态分值明显增高(P <0.05 )。(2)与ACR组相比,联合组大鼠第4、5周时步态分值明显降低,分别下降22.92 %、15.85 %(P <0.05),其余各周无明显变化。结论:ACR对大鼠神经行为的影响主要表现为步态异常。同时给予MT处理后,在ACR中毒早期,MT能减轻步态的异常改变,后期无缓解作用。二、MT干预下ACR对大鼠神经组织病理损伤的影响目的:探讨MT同时干预对ACR引起大鼠神经组织病理损伤的影响。方法:试验动物及分组同第一部分(每组3只)。在末次给药24 h后,各组大鼠均断头处死,在冰盘上取出大脑、小脑、坐骨神经,10 %的甲醛固定,按常规石蜡包埋、切片,HE染色,光学显微镜观察大鼠大脑、小脑、坐骨神经组织的改变。结果:光镜下可见(1)对照组及MT组大鼠大脑各细胞层次清楚;ACR组血管扩张充血,炎症细胞浸润;联合组与ACR组相比症状明显改善,未出现血管扩张充血及炎症细胞浸润,恢复到对照组水平。(2)对照组大鼠小脑从外向内具有明显的三层结构,分子层、蒲肯野细胞层及颗粒细胞层;其余三组无明显异常。(3)对照组大鼠坐骨神经有髓纤维分布均匀,髓鞘完整,其余三组未见明显改变。结论:ACR对大鼠大脑有一定损害,主要表现为血管扩张充血,炎症细胞浸润,对小脑及坐骨神经无明显影响;MT能够改善血管扩张,并具有明显的抗炎作用。三、MT干预下ACR对大鼠脑组织氧化损伤的影响目的:探讨MT同时处理对ACR致大鼠脑组织氧化损伤的研究。方法:实验动物及分组同第一部分(每组10只)。在末次给药24 h后,各组大鼠均断头处死,在冰盘上分离大脑皮层、小脑,全能酶标仪比色测定脑组织匀浆液中的丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽(GSH)含量和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性。结果:在本试验中,(1)与对照组比较,ACR组大脑皮层SOD活性降低9.89 % (P <0.05),MDA、GSH含量及GSH-PX活性变化不明显(P >0.05);MT组SOD活性升高8.67 % (P <0.05);联合组各指标与对照组相比无明显差异。与ACR组比较,联合组SOD活性升高14.96 %(P <0.01)。(2)与对照组比较,ACR组小脑SOD活性和GSH含量分别降低7.49 %、12.31 %(P <0.05),GSH-PX活性及MDA含量变化不明显(P >0.05);MT组及联合组各指标与对照组比较无明显差异。与ACR组比较,联合组SOD活性及GSH含量有所升高,但无统计学意义(P >0.05),MDA含量及GSH-PX活性均无明显改变(P >0.05)。结论:ACR可抑制大鼠大脑皮层、小脑组织中的SOD活性并降低小脑GSH含量,从而降低机体的抗氧化能力,但脂质过氧化产物MDA并没有明显升高,提示脂质过氧化可能不是本模型中ACR中毒的主要机制。MT的同时干预可以使抗氧化酶SOD活性及GSH含量恢复到机体水平。综上所述,在本动物模型中,ACR对大鼠的一般毒性作用主要表现为食物利用率下降,体重降低,大脑和小脑脏器系数增高;神经毒性作用主要表现为步态改变,大脑血管扩张充血,炎症细胞浸润,大脑皮层、小脑组织SOD活性及小脑GSH含量降低。同时给予MT干预后,对ACR的一般毒性无明显缓解作用,对ACR引起的异常步态早期有一定缓解作用,后期不明显;但MT能明显改善大脑血管扩张和炎性细胞侵润,并可以提高抗氧化酶SOD活性及GSH含量。长期使用MT对大鼠体重有一定的影响,MT的安全性值得关注。