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前言 肥胖被视为一种以身体脂肪含量过多为主要特征的、原因复杂的、能够合并多种疾患的慢性病,它与心脑血管疾病、高血压、糖尿病、脂代谢紊乱等密切相关。随着我国社会经济的发展和人民生活水平的提高,肥胖已成为我国二十一世纪最常见的健康问题之一。肥胖的研究已经受到各国学者的普遍关注。1994年底,首次从小鼠和人体内发现并克隆出肥胖基因(ob基因)以来,世界各国掀起了ob基因研究的热潮,肥胖研究进入了分子生物学时代。 由于肥胖的病因复杂,以人为对象研究肥胖发生的生物学机制十分困难,采用动物模型可得到从人类无法获得的信息。1983年,Levin等人发现喂高脂饲料的同一批大鼠,部分发生肥胖,部分不发生肥胖。1994年,Lauterio等人发展了此模型,高脂饮食时,根据体重增加程度不同,处于上游亚群的称为膳食诱导肥胖(diet-induced obesity,DIO),处于下游亚群的称为膳食诱导肥胖抵抗(diet-induced obesity resistant,DIO-R),介于两者之间弃之。Lauterio等人研究膳食诱导肥胖的SD大鼠,高脂饲料喂养后,DIO大鼠与DIO-R大鼠血清瘦素(leptin)水平都升高,但DIO大鼠血清瘦素水平比DIO-R大鼠高。Watson等研究认为神经肽Y mRNA(NPY mRNA)减少在肥胖抵抗中起到一定作用。DIO和DIO-R大鼠两者有何区别,下丘脑NPYmRNA和血清瘦素水平如何变化及两者与肥胖抵抗的关系如何,本文着重探讨这几个问题,为今后揭示肥胖抵抗的机制,提供理论依据,并为肥胖研究提供新的思路。 目的 1.研究DIO和DIO-R大鼠在给予高脂饮食早期和晚期的体脂含量,血清瘦素、胰岛素水平的变化。 2.探讨DIO和DIO-R大鼠下丘脑弓状核NPY mRNA的表达。3.探讨瘦素与神经肤Y mRNA关系。4.探讨瘦素、神经肤Y mRNA与肥胖抵抗关系。实验材料和方法 一、实验材料 1.实验动物:雄性健康Wistar大鼠共52只,体重200士209,中国医科大学实验动物中心提供。 2.瘦素、胰岛素放射免疫试剂盒,购于中国人民解放军总医院放免研究所。 3.NPY mRNA检测试剂:生物素标记的NPY DNA单链寡核昔酸探针购于TaKaRa公司,原位杂交试剂盒购于美国Invitrogen公司。 4.饲料配方和主要营养成分: 基础饲料配方(1009):豆粕259、黄豆59、玉米309、酵母2.59、鼓子109、鱼粉109、骨粉2.59、高粱59、标准粉8.59、豆油19、盐0.59。 高脂饲料配方(l 009):基础饲料449、鸡蛋209、奶粉1 59、猪油巧g、鲜黄豆芽59、鱼肝油19。 二、实验方法 1.动物的分组与饲养 动物适应性饲养lw后,将动物随机分为2组:第一组为24只,随机分对照组6只,实验组18只,实验Zw末处死;第二组28只,随机分对照组7只,实验组21只,实验12w末处死。对照组给予基础饲料,实验组给予高脂饲料。动物室温度22士3℃,相对湿度45%一5%,自由饮水摄食,体重每周记录一次。 2.标本的采集与处理 2.1血清采集:所有大鼠分别在正式实验开始后Zw末和12w末,禁食12h,于下腔静脉取血5耐。采集的血样在室温下静置Zh后,以3000rpm离心20而n,分离血清,密封,于一70℃深冻冰箱中保存,待测。 2.2脂肪垫取材:剖开腹腔,分离肾周、附翠、肠系膜脂肪垫,称重并冷冻保存(一O℃)。 2.3脑组织取材:取血后,大鼠断头处死,迅速取出下丘脑组织,处理后恒温冷冻切片,每一动物下丘脑弓状核平面取4张切片,片厚13卜m,切片自然干燥后于一O℃深冻冰箱保存,待测。 3.DIO及DIO一R大鼠的判定 实验组高脂饲料喂养Zw、12w后,按体重由高至低排序,体重位于上游的前1乃大鼠判定为DIO大鼠,体重位于下游的后1/3大鼠为DIO一R大鼠,介于两者之间的弃之。 4.指标的检测 4.1血清瘦素水平测定:平衡法,按瘦素放射免疫分析试剂盒中的使用说明进行操作。 4.2血清胰岛素水平测定:采用放射免疫分析方法,按胰岛素放射免疫分析试剂盒中的使用说明进行操作。 4.3下丘脑弓状核NPY mRNA测定:原位杂交方法。结果判定采用图象分析系统(MetaMo印h Im娜即stemv4·6)。 5.统计分析 采用SPSS统计软件进行统计学分析,实验数据用又*s表示,各指标的比较采用单因素方差分析,随后采用LSD法进行两两比较。相关性分析采用Pearson相关分析。实验结果 1.实验期内,DIO组、DIO一R组和对照组大鼠体重的变化 实验前三组大鼠体重并无明显差异(P>0 .05),但到实验Zw末,喂高脂饲料的大鼠体重开始分化,DIO组大鼠体重显著高于DIO一R组和对照组大鼠(P<0.01);到实验12w结束时,DIO组大鼠体重仍显著高于DIO一R组和对照组大鼠(P<0.01)。DIO一R组与对照组大鼠相比体重始终没有显著性差异(p>0.05)。 2 .DIO组、DIO一R组和对照组大鼠腹部脂肪储存状况的比较 实验Zw末,Dlo组大鼠附攀部脂肪、肾周脂肪、肠系膜脂肪、总脂肪及单位体重脂肪(单位体重脂肪(留kg)二总脂肪垫重量/体重)显著高于DIO-R组和对照组大鼠(P<0.01);DIO一R组大鼠各脂肪垫水平同对照组大鼠相比无差别(