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水稻ROP基因OsRac5是从雌雄蕊形成期幼穗中分离得到的功能未知基因。前期研究发现,该基因与光敏核不育水稻农垦58S光周期育性转换相关;该基因在水稻生长发育过程中在多种组织中广泛表达,其中在幼穗中表达量最高;为鉴定该基因的功能,实验室前期已经构建了其RNA干扰水稻,本研究进一步利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建该基因的敲除水稻,以野生型日本晴水稻(WT)、该基因的RNA干扰水稻(RNAi-OsRac5)和敲除水稻(Cas9-OsRac5)为材料,对该基因在水稻生长发育中的功能进行初步鉴定。对RNAi-OsRac5水稻的PCR和qRT-PCR检测结果表明,与WT水稻相比,检测的18个株系均为转基因株系,其中OsRac5基因在15个转基因株系中的表达水平均极显著下调,下调幅度为对照组的0.15~0.78倍,可以作为后续实验的材料。采用CRISPR/Cas9技术对OsRac5基因进行编辑,将构建的Cas9-OsRac5载体转化日本晴水稻,PCR和测序证实,在T0代获得6个杂合转基因株系,在T1代筛选获得10个纯合敲除株系,突变的本质为碱基的缺失和/或插入;对不同纯合敲除株系中OsRac5基因预期编码蛋白的氨基酸序列进行多序列比对,结果显示,在10个纯合敲除株系中,OsRac5序列都发生了移码突变和无义突变,引起氨基酸序列的改变,将导致OsRac5截短蛋白的生成。由于截断蛋白保守的GTP/GDP结合位点丧失,GTP酶结构域不完整,因此预期在10个纯合敲除株系中将没有正常OsRac5蛋白生成。对水稻种子进行萌发相关实验,结果显示,与WT水稻相比,RNAi-OsRac5和Cas9-OsRac5水稻种子萌发完成时间分别提前12 h、24 h;在水稻种子萌发3 d、5 d和7d的时候,与WT水稻相比,RNAi-OsRac5水稻的胚根伸长量均极显著增加(分别增加1.95倍、1.09倍和1.14倍左右),胚芽伸长量均极显著增加(分别增加0.61倍、0.71倍和0.49倍左右);Cas9-OsRac5水稻的胚根伸长量均极显著增加(分别增加2.14倍、1.2倍和1.22倍左右),胚芽伸长量均极显著增加(分别增加0.81倍、0.77倍和0.59倍左右)。说明OsRac5基因敲除或表达水平下调,促进了水稻种子萌发与幼苗生长。对水稻小孢子发育8个典型阶段进行细胞学观察,结果显示,RNAi-OsRac5和Cas9-OsRac5水稻在第1至第6阶段,与WT水稻相比,没有出现明显差异,但在第7阶段(小孢子晚期)出现小孢子萎缩,异常空泡化现象,第8阶段(成熟花粉期)出现更多异常干瘪的花粉粒;对成熟花粉粒进行染色,观察统计活性花粉数,结果显示,与WT水稻相比,RNAi-OsRac5和Cas9-OsRac5水稻的可育花粉比率极显著降低(分别减小13.4%、20.2%左右)。说明OsRac5基因敲除或表达水平下调,影响了小孢子晚期发育,进而影响了花粉的成熟过程,导致可育花粉比率下降。在抽穗期,对剑叶生理指标进行测定,结果显示,与WT水稻相比,RNAi-OsRac5和Cas9-OsRac5水稻的净光合速率均极显著降低(分别减小9.7%、32.7%左右),而RNAi-OsRac5蒸腾速率没有明显变化,Cas9-OsRac5水稻蒸腾速率极显著降低(减小27.2%左右)。在成熟期,对水稻进行农艺性状统计,结果显示,与WT水稻相比,RNAi-OsRac5和Cas9-OsRac5水稻的株高均显著升高(分别增高6.6%、6.0%左右);有效分蘖数均极显著减少(分别减少37.5%、40.5%左右);穗实粒均极显著降低(分别降低8.5%、15.1%左右);RNAi-OsRac5结实率显著降低(降低6.0%左右),Cas9-OsRac5水稻结实率极显著降低(降低19.7%左右);RNAi-OsRac5水稻千粒重没有明显变化,Cas9-OsRac5水稻千粒重显著降低(降低12.4%左右);穗长、一级枝梗数、穗总粒、粒长和粒宽等性状没有明显变化。本研究基于实验室前期工作,利用CRISPR/Cas9技术构建了10个水稻OsRac5基因敲除纯合株系,以野生型日本晴水稻(WT)、OsRac5基因RNA干扰水稻(RNAi-OsRac5)和OsRac5基因敲除水稻(Cas9-OsRac5)为实验材料,开展OsRac5基因的功能研究,发现该基因的功能涉及水稻种子萌发、幼苗生长,以及育性、株高、分蘖数、结实率等重要农艺学性状,为深入研究该基因的功能奠定了基础,同时也为探讨该基因在水稻分子设计育种上的价值提供了重要依据。