本文采用显微技术和透射电镜技术,观察了河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)在不同镉浓度和处理时间下肝胰腺组织细胞的病理学变化;利用TUNEL技术、比色法、电镜细胞化学技术、酶组织化学和激光共聚焦手段,检测了肝胰腺组织细胞中的凋亡率,caspase-3、caspase-8、caspase-9活性,琥珀酸脱氢酶(SDH)、乳酸脱氢酶(LDH)和钙ATP酶(Ca2+-ATPase)的活性,细胞浆和线粒体内细胞色素c(cyt c)的含量,线粒体膜电位(Δψm)的变化;利用基因克隆、实时荧光定量PCR技术等手段,检测了热休克蛋白70(HSP70)和细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(CCO-Ⅰ)mRNA的表达,从机体对损伤应答的角度探讨了镉离子对肝胰腺组织的毒性作用机制。实验设对照组和五个镉离子浓度组(3.56,7.12,14.25,28.49和56.98 mg/L),进行体外染毒,处理时间为24,48,72和96h。本研究主要内容包括：　　⑴镉对河南华溪蟹肝胰腺组织细胞的形态学改变。肝胰腺组织发生细胞水肿、凋亡和坏死性凋亡,损伤程度随染毒时间延长和染毒浓度增加而加重。水肿的细胞在各染毒组中均有不同程度出现,表现为体积增大、胞浆淡染,严重时造成细胞死亡。染毒48和72 h时,光镜下可观察到较多的细胞凋亡,而在56.98 mg/L浓度组出现明显的细胞连续性中断、坏死及血淋巴细胞浸润。凋亡的细胞体积变小,胞浆嗜酸性增强,细胞核固缩、深染。同时,透射电镜观察到典型的凋亡小体:细胞核皱缩,染色质凝集在核膜下,胞浆中各细胞器基本消失,只留有少许线粒体。细胞核和线粒体出现明显损伤,线粒体肿胀、膜破裂、嵴变短变少,甚至消失,线粒体呈双层膜囊泡状改变。溶酶体数量增多,出现较多巨大的吞噬大量自身成份的自噬溶酶体。细胞衣和P/Ca颗粒随染毒浓度增加而逐渐消失。高镉浓度组中粗面内质网和高尔基复合体形态结构明显改变。　　⑵镉诱导河南华溪蟹肝胰腺组织出现细胞凋亡与线粒体损伤：镉染毒24h,随着浓度的增加凋亡指数明显增高,SDH、Δψm、线粒体内cyt c含量、Ca2+-ATPase活性逐渐增加。SDH与Δψm、线粒体内cyt c,Δψm与线粒体内cyt c含量,Ca2+-ATPase与Δψm之间有正相关关系。但是胞浆中cyt c含量无明显变化(p>0.05)；镉染毒48 h,AI显著增加(p<0.05)。caspase-3、caspase-9、SDH活性、线粒体内cyt c含量、Δψm、Ca2+-ATPase活性随镉浓度的增加而显著增加(p<0.05),并在最高浓度组达到最大。caspase-3与caspase-9,caspase-3与AI、SDH的活性,线粒体内cyt c含量与Δψm,Δψm与SDH,SDH与Ca2+-ATPase,Ca2+-ATPase与线粒体内cyt c含量之间有正相关关系。胞浆中cyt c含量无明显变化(p>0.05)；镉染毒72 h,AI显著增加(p<0.05)。caspase-3、caspase-9、SDH活性、Δψm、Ca2+-ATPase活性伴随染毒浓度的增加先增后降。电镜细胞化学技术显示,SDH主要位于线粒体嵴上,随染毒浓度增加其活性先增后降。线粒体内cyt c含量在56.98 mg/L组显著降低(p<0.05)。caspase-3和caspase-9的活力在3.56、7.12和14.25 mg/L浓度组显著增高(p<0.05),之后活性逐渐降低到对照组水平,二者之间存在正相关关系。但是,它们与AI没有相关性(p>0.05)。caspase-3、caspase-9与SDH,SDH与Δψm、Ca2+-ATPase之间存在正相关关系。Δψm在7.12 mg/L组显著性最高(p<0.05),而在56.98 mg/L组显著性最低(p<0.05)。此时,AI从28.49 mg/L组的23％骤增到56.98 mg/L组的32.9%,Ca2+-ATPase在3.56、7.12和14.25 mg/L组显著增加(p<0.05)。Δψm与Ca2+-ATPase、线粒体cyt c含量之间有正相关关系。可是,胞浆中cyt c含量虽然没有明显变化(p>0.05),但是随着浓度的增高有增多的趋势；镉染毒96 h,SDH活性、Δψm、线粒体内cyt c含量、Ca2+-ATPase活性随染毒浓度增加先增后降,且均在56.98 mg/L组受到显著抑制(p<0.05)。随镉浓度增加,AI显著增加(p<0.05),从28.49 mg/L组的45.5%骤增到56.98 mg/L组的64.4%。SDH与Δψm、线粒体内cyt c、Ca2+-ATPase活性,线粒体内cyt c含量与Δψm、Ca2+-ATPase活性,Δψm与Ca2+-ATPase活性之间有正相关关系。胞浆中cyt c含量在7.12和56.98 mg/L组显著性增加(p<0.05),并且cyt c在胞浆和线粒体中的含量有负相关关系。　　⑶克隆出河南华溪蟹肝胰腺组织中HSP70和CCO-Ⅰ的部分基因序列。镉暴露72 h时,HSP70和CCO-ⅠmRNA的表达在各染毒组中无显著性变化(p>0.05),但是表达有先增高后降低的趋势。HSP70 mRNA的表达在14.25 mg/L组达到最高,为对照组的2.36倍,在56.98 mg/L组降到与对照组一致。CCO-ⅠmRNA的表达在7.12 mg/L组达到最高,为对照组的1.7倍,而在56.98 mg/L组仅为对照组的0.53倍。　　⑷实验结果表明：①河南华溪蟹暴露于镉,肝胰腺组织出现不同程度的损伤,其中线粒体和细胞核的损伤最为明显。高浓度和长时间镉作用后,由于除了线粒体和细胞核的损伤之外,其他细胞器也受到严重损伤,因此引起肝胰腺组织细胞的蛋白合成、组装、转运等生理过程受阻,肝胰腺发生严重功能损伤,最终将导致蟹体死亡。②虽然线粒体最初受到损伤,但是作为整体动物实验,溪蟹可调动机体的各种代偿机制来对抗镉的毒性。因此,正常的或损伤轻的细胞、线粒体代偿性做功增加,表现为SDH活性、线粒体膜电位、细胞色素c含量增加等。当更多的、损伤重的线粒体出现后,将引起细胞能量衰竭,SDH活性、线粒体膜电位、Ca2+-ATPase活性受到抑制,导致细胞死亡。③镉染毒48 h时,镉对肝胰腺细胞的损伤以诱导细胞凋亡为主,并且细胞凋亡的发生是通过线粒体的caspase-dependent通路实现的。在暴露72 h后,不能排除caspase-independent通路的参与。无论是哪种通路诱导的细胞凋亡,凋亡的发生一方面使得出现不可逆损伤的细胞通过对机体损伤最轻微的方式被清除掉,另一方面这种过多的细胞死亡也会影响组织器官的功能。④HSP70基因的不表达,使镉可以从基因水平上抑制肝胰腺组织的防御功能;CCO-Ⅰ基因的不表达,导致CCO耗竭或活性降低,最终使线粒体的功能降低。镉对HSP70和CCO-Ⅰ基因的抑制导致肝胰腺组织的损伤加重。