论文部分内容阅读
鳜(Siniperca chuatsi)和虹鳟(Oncorhynchus mykiss)是中国和北美食用十分广泛的淡水经济养殖鱼类,同时也是基础研究的重要模式生物。对其免疫系统及相关分子的研究对了解种系发生和系统发育有重大的意义,同时对鱼病防治和健康养殖也有直接的指导作用。因此,本论文对鳜免疫球蛋白重链IgD基因进行了克隆和特性分析,同时对虹鳟鱼过敏毒素的功能进行了初步研究,首次证实了非哺乳动物中补体系统和Toll样受体之间存在相互对话的现象。
用RACE-PCR和RT-PCR方法获得鳜膜结合型免疫球蛋白D(membrane-bounded IgD,mIgD)重链基因全长cDNA序列。鳜mIgD的cDNA全长为3358 bp,其5’非编码区包含30 bp,3’非编码区包含337 nt;开放阅读框包含2991 bp,编码996 aa,基因结构为VDJ-μ1-δ1-δ2-δ3-δ4-δ5-δ6-δ7-TM。鱼类IgD恒定区氨基酸序列比对结果显示,鳜mIgD存在半胱氨酸和色氨酸保守位点,与其他鱼类IgD的相似性在37%-72%之间。用邻接法(NeighborJoining)构建的鱼类免疫球蛋白基因的系统发育树表明,鱼类IgD形成独立的一支,鳜mIgD与牙鲆和庸鲽IgD聚为一支。荧光定量PCR结果显示鳜mIgD的mRNA主要分布于外周血白细胞、胸腺、头肾、中肾和脾脏中。研究发现,鳜mIgD还有另外一种形式,即缺失外显子6的转录体,该模式分子在淋巴组织中的表达水平明显低于完整模式分子的表达水平。另外,PCR扩增了鳜IgM/lgD重链基因组序列,长约10 kb,δ基因紧邻μ基因,位于μ的下游,两者在基因组上的距离小于3 kb。原核表达鳜IgD蛋白,纯化后,制备了兔多克隆抗体。免疫印迹结果显示,在鳜头肾、肾脏、脾脏和性腺中检测到一条45 kDa特异条带,小于预期分子量,还有待进一步证实。
许多细菌可通过旁路途径激活补体系统。补体系统被激活后,过敏毒素C3a和C5a即被释放,经受体识别,启动多种炎症反应。同时,被活化的补体系统将杀死病原菌,致使其各种微生物产物也被释放(如脂多糖,肽聚糖,细菌核酸DNA等),并将被多种模式识别受体所识别,包括Toll样受体。我们推测,伴随着病原微生物的感染,补体活化组分和Toll样受体的配体将同时被释放,补体系统和Toll系统之间可能存在着双边对话现象,从而导致两个系统的受体表达水平分别上调,以便更加快速有效的去识别内源性或外源性的危险信号物。本研究应用实时荧光定量PCR的方法发现,LPS、PGN等Toll样受体的配体有能力上调虹鳟鱼外周血白细胞和头肾白细胞内C3aR和C5aR的表达水平。相对应的,我们发现虹鳟鱼过敏毒素C3a和C5a能够上调外周血白细胞和头肾白细胞内TLR3和TLR5m的表达水平。这是第一次有关过敏毒素可以上调TLRs表达水平的报道。同时,我们的研究结果也充分的证明了,Toll系统和补体系统之间早在低等脊椎动物物种中就建立了相互的信号对话。我们相信,建立在这两个古老系统之间的相互对话,会给生物体发出更强的警惕信号,使得在病原菌感染过程中释放的内源性或外源性的危险信号被信号分子识别受体更快更有效的识别。