【摘 要】
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N末端B型利钠肽原（N?terminal pro-B-type natriuretic peptide,NT-proBNP）已成为心力衰竭（Heart failure,HF）疾病诊断和预后判断的“金标准”生物标志物。心力衰竭相关指南也将其列为推荐标志物。目前,临床上检测NT-proBNP以免疫法为主,具有快速、便捷的优势。但国内外尚未研制出NT-proBNP的标准物质,这导致不同厂家的诊断试剂产品
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N末端B型利钠肽原（N?terminal pro-B-type natriuretic peptide,NT-proBNP）已成为心力衰竭（Heart failure,HF）疾病诊断和预后判断的“金标准”生物标志物。心力衰竭相关指南也将其列为推荐标志物。目前,临床上检测NT-proBNP以免疫法为主,具有快速、便捷的优势。但国内外尚未研制出NT-proBNP的标准物质,这导致不同厂家的诊断试剂产品测量结果不具有可比性。为了实现NT-proBNP标准化检测,亟需建立NT-proBNP蛋白标准测量方法。研究以重组的NT-proBNP蛋白为研究对象,采用蛋白免疫印迹法（Western-blot）验证蛋白免疫原性以及采用基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）和电喷雾液质联用四级杆飞行时间质谱仪（LC-ESI-Q-TOF-MS）准确测量NT-proBNP的相对分子质量。基于具有计量学溯源性的液相-同位素稀释串联质谱法（LC-IDMS）对NT-proBNP样品进行定值。建立了免疫磁珠富集NT-proBNP蛋白的方法,验证方法有效性。具体研究结果如下:蛋白免疫印迹法检测NT-proBNP样品的条带较为清晰并无其他杂带,其分子量在6.5 k Da与10 k Da之间,能够清晰观察到化学发光信号。表明NT-proBNP样品的纯度较高并具有免疫原性,可作为标准物质候选物。通过MALDI-TOF-MS以及LC-Q-TOF-MS确定NT-proBNP蛋白的相对分子质量为8590 Da。建立液相-同位素稀释串联质谱法（LC-IDMS）准确测量NT-proBNP的方法,包括基于氨基酸水平的同位素稀释串联质谱法以及基于肽段水平的同位素稀释串联质谱法。在基于氨基酸水平的同位素稀释质谱法中,通过对NT-proBNP蛋白中精氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸的测量实现对NT-proBNP的准确定量。实验过程中优化质谱条件和优化NT-proBNP蛋白的水解时间。依据同位素稀释法的公式以及NT-proBNP中目标氨基酸的测量结果,计算得出NT-proBNP蛋白的含量为78.99μg/g,RSD值为1.31%,相对标准不确度1.86%,定量结果具有溯源性。在基于肽段水平的同位素稀释质谱法中,高分辨质谱对NT-proBNP经胰蛋白酶和Clu-C酶（V8蛋白酶）酶切后产物进行检测。最终,选择QE（QRNHLQGKLSE）和SE（SPRPTGVWKSRE）两条肽段作为NT-proBNP的特征肽进行后续定量。实验过程中优化质谱条件和优化NT-proBNP蛋白的酶解条件。依据同位素稀释法公式以及肽段QE和SE的含量测量结果,计算得到NT-proBNP蛋白的含量为76.04μg/g,RSD值为1.85%,相对标准不确度3.92%。建立免疫磁珠富集NT-proBNP蛋白的方法。优化磁珠与抗体最佳结合时间为18h,NT-proBNP蛋白与抗体的最佳比例为1:1,验证了免疫磁珠富集NT-proBNP蛋白的有效性。研究建立的基于氨基酸水平以及肽段水平的同位素稀释质谱法测定NT-proBNP蛋白含量的结果准确、可靠、重复性好并可溯源至SI单位,为标准测量方法的建立以及相关蛋白标准物质的研制奠定了基础。建立免疫磁珠富集NT-proBNP蛋白的方法,有望成为血清中低浓度NT-proBNP蛋白的准确定量的前处理方法。
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