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研究背景和目的细胞色素P450s(cytochrome P450 enzymes,CYPs)是人体重要的Ⅰ相药物代谢酶,主要分布在肝脏、肠道和肾脏,参与了大多数内源性和外源性物质的代谢。CYPs 主要由 CYP1(A1/B1)、CYP2(A6/B6/C8/C9/C19/D6/E1/J2)及CYP3(A4/A5/A7)3个亚家族组成,其药物代谢量约占人体总药物代谢量的75%,CYP3A亚家族在整个CYPs中表达最高,其中CYP3A4是肝脏中最重要的代谢酶,60%临床处方药物经其代谢。不同个体中CYPs酶活性和基础表达的明显个体差异将导致药物的代谢及清除率的个体差异,严重影响临床用药的安全性和有效性。因此,阐明CYPs表达的分子调控机制,找出CYPs个体差异的主要原因,对精准医疗以及临床用药有着重要的指导意义。以往的研究发现CYPs酶的遗传多态性仅能解释大约10-30%的个体差异。许多研究表明,CYPs的表达也同时受到许多转录因子的调控,如肝细胞核因子4α(HNF4α)、肝细胞核因子1α(HNF1α)、雄烷受体(CAR)、芳基烃受体(AHR)和孕烷X核受体(PXR)等。近年来,日益增多的研究表明CYPs表达的个体差异受到组蛋白修饰、DNA甲基化以及microRNAs调控。然而关于长链非编码RNA(long-noncoding RNAs,lncRNAs)调控CYPs表达机制的研究却知之甚少。基于课题组前期的工作基础,本课题探讨lncRNA HNF4A-AS1参与转录因子介导调控CYPs表达的分子机制,以人肝癌细胞系Huh7细胞为研究对象,实验分以下三部分:①利用功能缺失性实验检测HNF4α对HNF4A-AS1、CYPs和转录因子基础及利福平诱导表达的调控作用;②利用功能获得性和功能缺失性实验检测HNF4A-AS1对CYPs和转录因子基础及药物诱导表达的调控作用;③探究HNF4A-AS1对CYPs基因启动子区组蛋白修饰的影响。本研究从lncRNAs调控的角度阐述CYPs表达个体差异的表观遗传调控机制,为CYPs的个体差异提供了新的解释,以期达到指导临床安全合理用药的目的。研究方法1.人肝癌细胞系Huh7细胞培养人肝癌细胞株(Huh7)培养于37℃、5%CO2及充分饱和湿度的无菌培养箱中,培养基采用含10%胎牛血清(FBS)、100 U/ml青-链霉素及2 mmol/LL谷氨酸的高糖DMEM培养液。2.RNA干扰和过表达实验采用siRNA干扰的方法分别敲低HNF4α、HNF4A-AS1的表达,进行功能性缺失实验;构建过表达质粒HNF4A-AS1,进行功能获得性实验。3.RT-qPCR检测相关基因基础表达和诱导表达的mRNA水平RT-qPCR 检测 siRNA 干扰(HNF4α 或 HNF4A-AS1)或过表达 HNF4A-AS148 h后对CYPs和转录因子基础表达和利福平(rifampicin,RIF)(10 μM)诱导表达水平。4.Western-Blot检测相关基因蛋白表达水平分别干扰HNF4α和HNF4A-AS1后,检测HNF4α,PXR,CYP3A4的蛋白表达水平。5.染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)-qPCR通过ChIP-qPCR探讨siRNA干扰HNF4A-AS1对CYP3A4基因启动子区HNF4α结合区域组蛋白修饰和HNF4α富集的影响。结果1.HNF4α对HNF4A-AS1、CYPs和转录因子基础及药物诱导表达的调控作用(1)siRNA干扰HNF4α对HNF4A-AS1、CYPs和转录因子的基础表达水平的影响在Huh7细胞系中使用siRNA有效干扰HNF4α 48 h后,与对照组相比,HNF4A-AS1 表达降低(P<0.05,n=3),CYP(1A2、2E1、2B6、2D6、2C8、2C9、2C19和3A4)的mRNA的表达以及转录因子(HNF1α、CAR、AHR和PXR)mRNA 表达均显著降低(P<0.05,n=3)。且 HNF4α PXR 和 CYP3A4蛋白表达水平与其mRNA表达水平一致(P<0.05,n=3)。(2)siRNA干扰HNF4α对HNF4A-AS1、CYPs和转录因子的药物诱导表达水平的影响siRNA 有效干扰 HNF4α 后暴露 RIF(10 μM)48 h,si-NC+RIF 与 si-NC 相比,HNF4A-AS1,CYP(1A2、2E1、2B6、2D6、2C8、2C9、2C19 和 3A4)及转录因子(HNF1α、CAR、AHR和PXR)mRNA表达水平均显著升高(P<0.05,n=3)。而 si-HNF4α+RIF 与 si-NC+RIF 相比,HNF4A-AS1、CYP(1A2、2E1、2B6、2D6、2C8、2C9、2C19和3A4)以及转录因子HNF1αmRNA表达水平较si-NC+RIF 显著降低(P<0.05,n=3)。2.HNF4A-AS1对CYPs和转录因子基础及药物诱导表达的调控作用(1)siRNA干扰HNF4A-AS1对CYPs和转录因子的基础表达水平的影响在Huh7细胞系中,siRNA有效干扰HNF4A-AS1 48h后,与对照组相比,CYP(1A2、2C8、2C9、2C19 和 3A4)和转录因子 HNF4α,PXR 的 mRNA 表达显著升高(P<0.05,n=3)。且HNF4α、PXR及CYP3A4蛋白表达水平与其mRNA 表达水平一致(P<0.05,n=3)。(2)siRNA干扰HNF4A-AS1对CYPs和转录因子的药物诱导表达的影响siRNA 有效干扰 HNF4A-AS1 后暴露 RIF(10 μM)48 h,si-NC+RIF 与 si-NC相比,HNF4A-AS1、CYP(1A2、2E1、2B6、2D6、2C8、2C9、2C19 和 3A4)及转录因子(HNF1α、CAR、AHR和PXR)mRNA表达水平均显著升高(P<0.05,n=3)。而 si-HNF4A-AS1+RIF 与 si-NC+RIF 相比 CYP(1A2、2C8、2C9、2C19和3A4)以及转录因子HNF4α,PXR的mRNA表达水平较si-NC+RIF显著升高(P<0.05,n=3)。3.过表达HNF4A-AS1对CYPs和转录因子的基础及药物诱导表达的影响(1)过表达HNF4A-AS1对CYPs和转录因子的基础表达水平的影响在Huh7细胞系中,过表达HNF4A-AS1 48 h后,与对照组相比,CYP(1A2、2E1、2B6、2C8、2C9、2C19 和 3A4)和转录因子 CAR,AHR 和 PXR 的 mRNA表达显著降低(P<0.05,n=3)。(2)过表达HNF4A-AS1对CYPs和转录因子的的药物诱导表达水平的影响过表达 HNF4A-AS1 后暴露 RIF(10 μM)48 h,OE-NC+RIF 与 OE-NC 相比,HNF4A-AS1,CYP(1A2、2E1、2B6、2D6、2C8、2C9、2C19 和 3A4)及转录因子(HNF1α、CAR、AHR和PXR)mRNA表达水平均显著升高(P<0.05,n=3)。而 OE-HNF4A-AS1+RIF 与 OE-NC+RIF 相比 CYP(1A2、2C8、2C9、2C19和3A4)以及转录因子PXR的mRNA表达水平较OE-NC+RIF显著降低(P<0.05,n=3)。4.siRNA干扰HNF4A-AS1对CYP3A4基因启动子区HNF4α结合区域的组蛋白修饰及HNF4α结合的影响在Huh7细胞中,siRNA有效干扰HNF4A-AS1 48 h后,CYP3A4启动子HNF4α结合区域的H3K4me3富集水平显著升高(P<0.05,n=3),同时CYP3A4启动子HNF4α结合区域的HNF4α富集水平也显著升高(P<0.05,n=3)。结论1.在人肝癌Huh7细胞系中,HNF4A-AS1反向调控HNF4α介导的CYPs和转录因子的基础及RIF诱导表达。2.HNF4A-AS1反向调控CYP3A4的表达与其基因启动子区组蛋白修饰H3K4me3和HNF4α富集的改变有关。